[發(fā)明專利]一種基于金字塔形納米結(jié)構(gòu)的適配體傳感器及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011624392.0
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112595764B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭業(yè)民;李建森;楊鳳珍;黃靖程;孫霞
• 申請（專利權(quán)）人: 山東理工大學(xué)
• 主分類號: G01N27/30
• 分類號: G01N27/30;G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種基于金字塔形納米結(jié)構(gòu)的適配體傳感器的制備方法，其特征在于，所述適配體傳感器用于辛硫磷、殺螟硫磷、倍硫磷、對硫磷和甲基對硫磷的檢測，所述制備方法包括如下步驟：

（1）玻碳電極的預(yù)處理；

（2）15 nm納米金粒子的制備；

（3）納米金-三維納米適配體的組裝，具體方法為

步驟1、經(jīng)計算所制備的納米金濃度為25 nM，將20 μg/mL的二水合雙（對-磺酰苯基）苯基膦化二鉀鹽加入制備好的納米金溶液，室溫下反應(yīng)12 h，10000 r/min離心除去粒徑不一致的上清液顆粒，加入0.5×TBE緩沖液恢復(fù)到原體積，取4份相同體積的納米金溶液在體系濃度為50 mM的氯化鈉環(huán)境中分別加入巰基修飾的S₁、S₂、S₃、S₄單鏈DNA，以1：8的摩爾比通過Au-S在單鏈DNA表面修飾金納米顆粒；

所述S₁的堿基序列為

5’-HS-ACATTAATGAAACATTACAGCTTGCTAGAGAAGAGCCGTTAGTGCAGGGGGAGGGGGATGGTGGCTCGCGGTGCGTGGTGGCTGT-3’；

所述S₂的堿基序列為

5’-HS-TATCAGAGTTGACATAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGTTAAGTGCAGGGGGAGGGGGATGGTGGCTCGCGGTGCGTGGTGGCTGT-3’；

所述S₃的堿基序列為

5’-HS-TCAACTCTGATAAAACTCAGCTACAATCTAACGGCTCTTCGTGCAGGGGGAGGGGGATGGTGGCTCGCGGTGCGTGGTGGCTGT-3’；

所述S₄的堿基序列為

5’-HS-TTCATTAATGTGCTTGTAGCTGAGTTTTTAACTCGCATGTGCAGGGGGAGGGGGATGGTGGCTCGCGGTGCGTGGTGGCTGT-3’；

步驟2、將具有部分互補堿基序列的納米金粒子與DNA的復(fù)合物兩兩混合，并且在90℃下水浴加熱5 min，之后停止加熱在水蒸氣中緩慢冷卻至室溫，經(jīng)過退火使2條單鏈DNA堿基互補的部分聚合成雙鏈結(jié)構(gòu)，連接穩(wěn)定，得到金二聚體，其次，各取200 uL金二聚體混合后加入5uL5M NaCl溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)24 h，得到金-三維納米適配體，將制備的金-三維納米適配體于4℃冰箱中保存；

（4）適配體傳感器的組裝：

滴加6 μL的金-三維納米適配體溶液到預(yù)處理過的GCE電極的表面，室溫下靜置自然干燥獲得AuNPs-DTN/GCE，然后，將AuNPs-DTN/GCE在0.5%牛血清白蛋白中孵育30min以阻斷非特異性結(jié)合位點，然后用超純水沖洗，并用氮氣吹干，最后得到BSA/AuNPs-DTN/GCE，儲存在4℃的冰箱中備用；所述金-三維納米適配體溶液的濃度為0.01μM；

（5）有機磷農(nóng)藥的測定：

電化學(xué)測試條件均為在pH 6.5的鐵氰化鉀溶液中采用循環(huán)伏安法進行掃描，掃描速度為50 mV/s，掃描電位為-0.2～0.6 V，記錄上述制備好的適配體傳感器被目標(biāo)物溶液孵育前后的還原峰值電流變化，根據(jù)所得電流差值的大小反映農(nóng)藥濃度；所述孵育時間為30min；所述鐵氰化鉀溶液中含有5 mM 鐵氰化鉀，5 mM 亞鐵氰化鉀和0.1 M KCl。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中所述15 nm納米金粒子的制備方法為

首先，在15 nm納米金的制備過程中所有玻璃器皿都在新制備的王水中浸泡12 h，然后使用超純水沖洗干凈備用，將0.5 mL 1%的HAuCl₄與50 mL的沸騰超純水混合并進行持續(xù)攪拌，然后將1.25 mL1%的檸檬酸三鈉溶液添加到上述溶液中，剛開始加入時溶液顯示淺灰色，直至溶液顏色出現(xiàn)明顯紫紅色，然后加熱使其保持沸騰狀態(tài)10 min后停止，持續(xù)攪拌至冷卻得到納米金顆粒，將其儲存于4℃環(huán)境下冷藏。