[發明專利]一種肌肉衛星細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 202011623303.0
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112608888A
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 張曉南;吳芳春;谷涌泉;侍曉云;張斌
• 申請（專利權）人: 北京昱龍盛世生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 李佳佳

1.一種肌肉衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟(1)、無菌條件下剪去腿部皮膚，取腿部肌肉，浸入緩沖液中；

步驟(2)、去除脂肪、骨骼及肌腱，用緩沖液反復清洗肌肉組織；

步驟(3)、在無菌條件下將肌肉組織剪成小塊，用膠原酶消化，使細胞分離；

步驟(4)、加入等體積的培養基，吹打后過濾，收集濾液，離心，棄上清，用培養基重懸細胞；將細胞懸液加入到培養皿中，細胞培養箱中培養；

步驟(5)、差速貼壁法進行細胞純化培養；

步驟(6)、待細胞匯合程度達到80％時，用胰蛋白酶消化傳代培養。

步驟(7)、細胞匯合程度達到90％以上時，進行細胞凍存；

所述步驟(1)-步驟(7)按照順序依次進行。

2.根據權利要求1所述的一種肌肉衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(1)中腿部肌肉為0.8-1.4mm³大小，緩沖液為PBS緩沖液，用量為20ml。

3.根據權利要求1所述的一種肌肉衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，(3)中剪碎的肌肉組織，用含2.0-3.0mmol/L氯化鈣的0.8-1.2％膠原酶消化，35-38℃，45min-90min，每15min吹打一次，使細胞分離。

4.根據權利要求1所述的一種肌肉衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(4)中培養基為DMEM/F12培養基，含有5-15％FBS。

5.根據權利要求1所述的一種肌肉衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(4)中，將細胞懸液加入到60mm的培養皿中，于35-38℃、4-6％CO₂細胞培養箱中培養。

6.根據權利要求1所述的一種肌肉衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(5)中，差速貼壁法進行細胞純化培養的方法為：35-38℃、4-6％CO₂培養1.5-2.5h，貼壁細胞為PA，吸取未貼壁細胞懸液轉皿培養10-14h,貼壁細胞為PB，繼續吸取未貼壁細胞懸液轉皿培養22-26h，貼壁細胞為PC，未貼壁細胞懸液轉皿培養22-26h，貼壁細胞為PD，未貼壁細胞懸液轉皿培養22-26h，貼壁細胞為PE，繼續培養2.5-3.5d后換液。

7.根據權利要求1所述的一種肌肉衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(6)中消化傳代培養的具體方法為：用PBS緩沖液洗滌細胞3遍，加入胰蛋白酶消化細胞，待細胞收縮變圓后輕輕吹打使細胞脫落，加入完全培養基終止消化，分皿培養。

8.根據權利要求1所述的一種肌肉衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(6)中加入0.2-0.3％胰蛋白酶0.4-0.6ml消化細胞。

9.根據權利要求1所述的一種肌肉衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(7)中細胞凍存的具體操作為：用PBS緩沖液洗滌細胞3遍，加入胰蛋白酶消化細胞，待細胞收縮變圓后輕輕吹打使細胞脫落，加入完全培養基終止消化，收集細胞，計數，1000r/min離心8min，棄上清，細胞凍存。

10.根據權利要求1所述的一種肌肉衛星細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(7)中加入0.2-0.3％胰蛋白酶0.4-0.6ml消化細胞。