[發(fā)明專利]一種非診斷和治療目的的過敏原蛋白T細胞表位多肽的鑒定和檢測方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011623255.5 | 申請日： | 2020-12-31 |
| 公開（公告）號： | CN112662726B | 公開（公告）日： | 2022-10-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李振興;許利麗;林洪;曹立民;孫禮瑞;張自業(yè);于闖;黃玉浩 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國海洋大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/02 | 分類號： | C12Q1/02;G01N33/68;G01N30/02 |
| 代理公司： | 青島致嘉知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37236 | 代理人： | 苗穎 |
| 地址： | 266100 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 診斷 治療 目的 過敏原 蛋白 細胞 多肽 鑒定 檢測 方法 | ||
1.一種非診斷和治療目的的過敏原蛋白T細胞表位多肽的鑒定和檢測方法，其特征在于，步驟如下：
（1）構(gòu)建液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測樹突狀細胞降解的多肽
將過敏原蛋白與樹突狀細胞共培養(yǎng)后的上清液進行超濾管離心，收集的濾液脫鹽處理后，進行UHPLC-MS/MS檢測；在NCBI蛋白庫中搜索過敏原蛋白氨基酸序列建立數(shù)據(jù)庫，將UHPLC-MS/MS檢測的數(shù)據(jù)采用Protein Pilot軟件在建立的數(shù)據(jù)庫中搜索比對，獲得樹突狀細胞降解過敏原蛋白的多肽序列；將上述降解的多肽進行合成，用于T細胞表位鑒定；
（2）構(gòu)建針對過敏原蛋白的T淋巴細胞模型，鑒定抗原表位多肽
將步驟（1）中合成的多肽分別加入到針對過敏原蛋白的T淋巴細胞中，檢測T淋巴細胞的增殖情況，能夠引起該T淋巴細胞增殖的多肽被認為是T細胞表位多肽；
（3）構(gòu)建Q-trap方法檢測上述T細胞表位多肽
合成步驟（2）中鑒定的T細胞表位多肽作為標品，構(gòu)建Q-trap方法檢測樣品中目標多肽的含量；
步驟（1）所述UHPLC-MS/MS檢測中，采用UPLC-Q-TOF數(shù)據(jù)依賴采集分析模式和數(shù)據(jù)非依賴采集分析模式對樹突細胞降解的多肽進行檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述過敏原蛋白T細胞表位多肽的鑒定和檢測方法，其特征在于，步驟（1）中，所述過敏原蛋白與樹突狀細胞共培養(yǎng)為：將樹突狀細胞調(diào)整為密度2×106/mL的懸液，按10μg/mL向樹突狀細胞懸液中加入過敏原蛋白，于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，加入預(yù)冷的PBS終止反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述過敏原蛋白T細胞表位多肽的鑒定和檢測方法，其特征在于，所述步驟（1）中采用Protein Pilot軟件進行搜庫比對的參數(shù)設(shè)置為：消化方式：none；選擇肽段條件為：①置信度＞90%；②FDR值≤1%；③沒有經(jīng)過修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述過敏原蛋白T細胞表位多肽的鑒定和檢測方法，其特征在于，所述樹突狀細胞為永生化細胞系和原代細胞中的任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述過敏原蛋白T細胞表位多肽的鑒定和檢測方法，其特征在于，所述永生化細胞系為小鼠髓系樹突狀細胞系DC2.4；所述原代細胞為脾或外周血來源的樹突狀細胞和其他品系小鼠來源的樹突狀細胞以及人屬外周血來源的樹突狀細胞中的任意一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述過敏原蛋白T細胞表位多肽的鑒定和檢測方法，其特征在于，所述T淋巴細胞為永生化細胞系和原代細胞中的任意一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述過敏原蛋白T細胞表位多肽的鑒定和檢測方法，其特征在于，所述永生化細胞系為抗原特異性T淋巴細胞系；所述原代細胞為小鼠脾T淋巴細胞、腸系膜淋巴結(jié)和派氏淋巴結(jié)T淋巴細胞以及人源外周血單核細胞中的任意一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7任一項所述過敏原蛋白T細胞表位多肽的鑒定和檢測方法，所述過敏原蛋白為原肌球蛋白、小清蛋白、肌鈣結(jié)合蛋白、卵清蛋白中的任意一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述過敏原蛋白T細胞表位多肽的鑒定和檢測方法，其特征在于，所述步驟（3）Q-trap檢測方法為：
通過Skyline對T細胞表位多肽進行MRM傳輸離子對的預(yù)測，并優(yōu)化母離子的碰撞能量和解簇電壓；前體離子電荷數(shù)選擇2或3；離子數(shù)電荷數(shù)選擇1,2；肽段離子碎裂類型為b，y；子離子質(zhì)荷比范圍為100-1250，通過對照Protein Pilot搜索比對結(jié)果，篩選T細胞表位多肽的離子對；
液相色譜條件：色譜柱：AdvanceBio Peptide Map column,150mm*2.1mm, 130 ?, 2.7μm, 柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；流動相A：0.1% 甲酸-水，流動相B：0.1%甲酸-乙腈，流速：0.35 mL/min，梯度洗脫程序如下：
時間（min） 流動相A 流動相B 0 95 5 0.5 65 35 2 50 50 6 95 5 8 95 5
質(zhì)譜條件為：電噴霧正離子（ESI+）模式；噴霧電壓：5500V；離子源參數(shù)設(shè)置：霧化氣壓力：60 psi，輔助加熱氣壓力：50 psi，氣簾壓力：35 psi，離子源溫度：575 ℃。
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