[發明專利]微流控芯片檢測17種番茄病原物的方法及引物

有效

• 申請號: 202011621115.4
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112725494B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 李寶聚;柴阿麗;康華軍;石延霞;謝學文;李磊
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/38;C12R1/01;C12R1/645;C12R1/77
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了微流控芯片檢測17種番茄病原物的方法及引物。本發明所要保護的一個技術方案是鑒定或輔助鑒定番茄病害病原物的組合物，所述組合物可由序列表中SEQ ID No.1?34中的17種引物對組成。將鑒定或輔助鑒定番茄病害病原物的組合物加入微流控芯片進行熒光PCR反應，通過對PCR產物的熒光信號進行讀取，可以完成17種常見番茄病害病原物的檢測。檢測的靈敏度高特異性強，有利于番茄病原物的快速鑒定。

技術領域

本發明屬于微生物分子檢測領域，具體涉及微流控芯片檢測17種番茄病原物的方法及引物。

背景技術

番茄是世界上消費量僅次于馬鈴薯的蔬菜。隨著番茄栽培面積的不斷擴大和種植年限的增加，番茄上的病害發展具有逐年加重的趨勢。據報道，侵染番茄的病原物有200多種，包括真菌、細菌、病毒和線蟲。生產上番茄經常發生的病害主要包括由茄鏈格孢(Alternaria solani，As)侵染引起的早疫病、由多主棒孢(Corynespora cassiicola，Cc)侵染引起的棒孢葉斑病、由灰葡萄孢(Botrytis cinerea，Bc)侵染引起的灰霉病、由辣椒疫霉(Phytophthora capsici，Phc)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum，Pa)和茄病鐮孢(Fusarium solani，Fs)侵染引起的根腐病、由茄匍柄霉(Stemphylium solani，Sts)侵染引起的灰葉斑病、由尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum，Fo)侵染引起的枯萎病、由核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum，Scs)侵染引起的菌核病、由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani，Rhs)侵染引起的立枯病、由煤污假尾孢(Pseudocercospora fuligena，Pf)引起的煤污病等真菌性病害；由丁香假單胞番茄致病變種(Pseudomonas syringae pv.tomato，Pst)侵染引起的細菌性斑點病、茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum，Ras)引起的青枯病、密執安棍狀桿菌密執安亞種(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm)引起的潰瘍病、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum，Pcc)軟腐病以及由野油菜黃單胞菌辣椒斑點致病變種(Xanthomonascampestris pv.vesicatoria，Xcv)引起的瘡痂病等細菌性病害；由番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)等侵染引起的番茄病毒病。這些病原物均可以侵染番茄，對番茄的產量和品質造成嚴重的影響，嚴重阻礙了番茄的正常生產，給廣大農民造成巨大的經濟損失。由于一些病原物在番茄上引起的癥狀具有一定的相似性，非常容易造成對病害的錯誤診斷，從而導致防治方法的不恰當。因此，準確鑒定發病番茄上的多種病原物，尤其是在發病初期進行檢測尤為重要。

傳統的對植物病原物的檢測方法如顯微鏡檢查，培養形態鑒定等不僅費時費力，并且對診斷人員的專業知識要求也高，且這些方法對細菌和病毒并不適用。免疫檢測技術可以有效的對病原物進行鑒定，但也存在靈敏性低、易產生假陽性的缺陷。近些年發展起來的分子生物學技術，逐漸用于檢測植物上的病原物。如經典PCR技術、巢氏PCR技術、熒光定量PCR檢測技術、隨機擴增多態性DNA標記檢測技術、等溫擴增檢測技術等，已經用于植物病原真菌、細菌和病毒的檢測。目前，番茄上的多種病原物已經建立了分子生物學檢測技術，可以在4小時內實現對單個樣本的檢測，準確性和靈敏性基本滿足實際的需要。但是，以上方法只能針對其中一種或少數幾種病原物同時鑒定，容易漏檢番茄植株上其他的病原物。多重PCR可以一個反應管中檢測多個靶標，但一次性可檢測到靶標一般不超過6個。由于田間番茄植株病害的頻發和多種病害復合發生的現象較多，亟需一種可同時檢測多種病原物的方法。