[發(fā)明專利]一種規(guī)模化制備人類細(xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011620605.2
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN112760354A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈政;程順巧;江振華
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢北度生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02;C12N5/07
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 張仁杰

1.一種規(guī)模化制備人類細(xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

S1、材料取樣：對人體的皮膚表面進(jìn)行消毒殺菌，從中取樣帶有細(xì)胞經(jīng)脫處理的皮膚，并對該細(xì)胞進(jìn)行低溫的保存，待需要使用時(shí)取出；

S2、基質(zhì)分離：利用冷酶交聯(lián)劑法進(jìn)行脫細(xì)胞處理，然后通過細(xì)胞的消化、破壁和離心對細(xì)胞進(jìn)行處理，靜止一端時(shí)間后產(chǎn)生細(xì)胞懸液，接著并對細(xì)胞懸液進(jìn)行分離和清洗，從而得到所需的細(xì)胞皮內(nèi)壁下的細(xì)胞外基質(zhì)，將得到的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行儲(chǔ)存；

S3、培養(yǎng)試驗(yàn)：從所得到的細(xì)胞外基質(zhì)取出相同容量的9等份，分別放置在對應(yīng)的9個(gè)培養(yǎng)皿中，并對培養(yǎng)皿中加入相同的培養(yǎng)液，利用該培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，然后將其放置在不同的環(huán)境下進(jìn)行不同時(shí)長的培養(yǎng)，并觀察器在培養(yǎng)過程中的變化；

S4、活性檢測：在對應(yīng)的時(shí)間完成后的培養(yǎng)皿優(yōu)先進(jìn)行檢測，通過殺菌消毒后的提取管進(jìn)行提取，并對提取管中的細(xì)胞外基質(zhì)溶液放入到檢測試劑盒中進(jìn)行檢測，得出對應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行比對。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種規(guī)?；苽淙祟惣?xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法，其特征在于：所述S1中所取用的為人體皮膚的皮膚組織細(xì)胞，并將其放置在5攝氏度的儲(chǔ)存箱中保存。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種規(guī)?；苽淙祟惣?xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法，其特征在于：所述S2中冷酶交聯(lián)劑法是利用利用雙功能或多功能試劑在酶分子之間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵連接來制備固定化酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種規(guī)模化制備人類細(xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法，其特征在于：所述S2中利用培養(yǎng)液對該細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞的消化的終止，并通過破壁機(jī)對細(xì)胞進(jìn)行破壁，對破壁后的細(xì)胞利用離心機(jī)進(jìn)行離心處理，離心速度為15Kr/min，需要重復(fù)操作2-3次，然后待其靜止。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種規(guī)?；苽淙祟惣?xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法，其特征在于：所述S2中的細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，分為清液和細(xì)胞外皮，對細(xì)胞外皮進(jìn)行收集，并將細(xì)胞外皮內(nèi)壁下的細(xì)胞外基質(zhì)提取出來后進(jìn)行保存。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種規(guī)模化制備人類細(xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法，其特征在于：所述S3中所取出的9等份細(xì)胞外基質(zhì)均為0.25mg，其中對培養(yǎng)皿加入的培養(yǎng)液均為等份的100ml溶液，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種規(guī)模化制備人類細(xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法，其特征在于：所述S3中所實(shí)驗(yàn)的環(huán)境分別為：實(shí)驗(yàn)環(huán)境1：5攝氏度下培養(yǎng)，且培養(yǎng)的時(shí)長分別為1h、2h和5h；實(shí)驗(yàn)環(huán)境2：20攝氏度下培養(yǎng)，且培養(yǎng)的時(shí)長分別為1h、2h和5h；實(shí)驗(yàn)環(huán)境3：37攝氏度下培養(yǎng)，且培養(yǎng)的時(shí)長分別為1h、2h和5h。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種規(guī)?；苽淙祟惣?xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法，其特征在于：所述S4中所采用的提取管通過高溫殺菌消毒，且提取管不進(jìn)行重復(fù)使用，同時(shí)提取的容量均為5ml進(jìn)行檢測。