[發明專利]一種山羊精原干細胞體外誘導分化培養方法

在審

• 申請號: 202011619481.6
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112646772A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 胡建宏;溫飛;任發;席華明;李宇;牛統娟
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 史玫

本發明公開了一種山羊精原干細胞體外誘導分化培養方法。所公開的方法包括采用同時添加有RA和BMP4的細胞培養液對山羊精原干細胞進行體外誘導分化培養。本發明通過外源添加RA和BMP4構建山羊SSCs體外誘導分化體系，有效提高了SSCs分化基因Stra8、c?KIT的表達，為SSCs應用于轉基因動物制備、生殖醫學和家畜資源保護等提供有效途徑。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體通過外源添加RA和BMP4構建一種山羊精原干細胞體外誘導分化體系。

背景技術

精原干細胞(SSCs)在精子發生中發揮舉足輕重的作用。SSCs是精子發生的基礎，既確保了源源不斷的產生精子，又保證了雄性動物生命過程中的生殖基礎，對于繁衍后代具有非常重要的作用。SSCs的分化和自我更新能夠保證SSCs數量處于動態平衡，如果在精子發生過程中出現分化受阻，將導致精原細胞的積累，從而影響精子的持續發生。SSCs的分化受到內在和外在因素的嚴格控調，睪丸內的細胞和細胞因子對于SSCs的分化具有重要的調控作用。

精原干細胞體外培養的建立首先是嚙齒動物，為家畜SSCs體外培養體系的建立提供了基礎。除目前公認的GDNF外，通過添加其他生長因子和激素也可以實現SSCs的長期培養。目前，在兔子、日本鵪鶉、樹鼩中成功建立了有效的長期培養體系，但關于大家畜尤其是山羊的SSCs研究進展十分緩慢，目前還沒有成功建立大家畜SSCs體外培養體系。

發明內容

針對現有技術的缺陷或不足，本發明提供了一種山羊精原干細胞體外誘導分化培養方法。

為此，本發明提供的山羊精原干細胞體外誘導分化培養方法包括：采用同時添加有RA和BMP4的細胞培養液對山羊精原干細胞進行體外誘導分化培養。

進一步，采用細胞培養液對山羊精原干細胞進行傳代培養，之后采用同時添加有RA和BMP4的細胞培養液對經傳達培養1～3次后的精原干細胞進行體外誘導分化培養。

進一步，本發明的方法包括：

(1)分離純化山羊精原干細胞；

(2)采用細胞培養液對分離純化的山羊精原干細胞進行傳代培養，之后采用同時添加有RA和BMP4的細胞培養液對經傳達培養1～3次后的精原干細胞進行體外誘導分化培養。

優選的，所述RA和BMP4的添加量分別為10±0.1nM和50±0.1ng/mL。

可選的，所述細胞培養液為含有FBS的DMEM培養基。

本發明通過外源添加RA和BMP4構建山羊SSCs體外誘導分化體系，有效提高了SSCs分化基因Stra8、c-KIT的表達，為SSCs應用于轉基因動物制備、生殖醫學和家畜資源保護等提供有效途徑。

附圖說明

圖1為分離純化前后的山羊精原干細胞電鏡圖，A為差貼前，B為差貼后；

圖2為山羊精原干細胞傳代培養3天后的克隆團電鏡圖，A為傳代培養前，B為經3傳代培養后；

圖3為傳代長期培養的山羊精原干細胞通過CD90/PLZF免疫熒光雙標記染色法鑒定及雙標記結果Merge融合圖；

圖4為實施例培養液中添加RA和BMP4培養24h后山羊精原干細胞分化相關基因表達圖。

具體實施方式

除非另有說明，本文中的術語根據相關領域普通技術人員的常規認識理解。

本發明是用同時添加有RA和BMP4的基礎細胞培養液對山羊精原干細胞進行體外誘導分化培養，其中基礎細胞培養液為適合山羊精原干細胞體外分化生長的培養液，包括但不限于現有技術已經公開的培養液，也可以是已與培養液自身的作用改進后的細胞培養液。