[發明專利]一種模擬IVIg的多人份混合人血漿IgG樣品的分離純化方法

有效

• 申請號: 202011619143.2
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112574296B
• 公開（公告）日: 2023-05-19
• 發明（設計）人: 馬莉;徐繼軒;張巍;杜晞;王宗奎;葉生亮;張容;王婭;李長清
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院輸血研究所
• 主分類號: C07K16/06
• 分類號: C07K16/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/18
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 易小藝

1.一種模擬IVIg的多人份混合人血漿IgG樣品的分離純化方法，其特征在于：包括以下具體步驟：步驟一：若干份血漿混合；

步驟二：混漿50％飽和硫酸銨法粗純化：

(1)步驟一混漿與飽和度100％的飽和硫酸銨溶液在常溫條件下按體積比1：1混合，靜置后離心，棄上清取沉淀；

(2)沉淀中加入平衡緩沖液后震蕩混勻充分溶解沉淀；平衡緩沖液體積與原混漿體積比為0.6-1：1；

(3)上述所得溶液經0.22μm孔徑超濾膜超濾后得粗蛋白樣品；樣品保存于4℃條件或冰上備用；

步驟三：粗蛋白離子交換層析純化：

(1)粗蛋白樣品通過脫鹽層析柱脫鹽處理，監視器紫外峰完全通過后重復上樣；

(2)除鹽后樣品通過離子親和層析柱結合粗蛋白IgG成分，使用洗脫緩沖液洗脫與填料結合的IgG成分，收集洗脫峰組分，再生液完全通過后可重復上樣；

(3)純化蛋白樣品保存于4℃條件或冰上備用；

步驟四：純化蛋白超濾及緩沖系置換：組分檢測后使用離心式超濾器對純化蛋白樣品進行超濾處理，根據所測蛋白濃度復溶至研究需要的蛋白濃度或IgG濃度，即得模擬IVIg的多人份混合人血漿IgG樣品成品；

所述步驟一和步驟二之間還有若干份血漿混合預處理步驟和混漿去冷沉淀步驟；

所述若干份血漿混合預處理步驟：獲取原料血漿，根據研究需求選用任意血漿份數、漿源類型、混漿比例、添加劑種類和數量條件制備成混漿；所述原料血漿為若干份新鮮血漿或凍存期2年以內的冰凍血漿；

所述步驟三的洗脫緩沖液為0.22μm濾膜超濾磷酸鹽緩沖液(PB)含0.2-0.8M精氨酸，pH＝7.5-8.5。

2.根據權利要求1所述的一種模擬IVIg的多人份混合人血漿IgG樣品的分離純化方法，其特征在于：所述步驟二中第(3)步中超濾為用離子交換柱Hitrap?Capto?MMC離子親和層析柱5mL×5；所述平衡緩沖液為0.22μm濾膜超濾磷酸鹽緩沖液，pH＝6.5，柱溫25℃，流速為1.5mL/min。

3.根據權利要求1所述的一種模擬IVIg的多人份混合人血漿IgG樣品的分離純化方法，其特征在于：所述洗脫緩沖液為0.22μm濾膜超濾磷酸鹽緩沖液(PB)，含0.5M精氨酸，pH＝8.0。

4.根據權利要求1所述的一種模擬IVIg的多人份混合人血漿IgG樣品的分離純化方法，其特征在于：所述步驟四中模擬IVIg的多人份混合人血漿IgG成品分裝后于4℃溫度條件下1周、-20℃溫度條件下1年、-80℃溫度條件下10年的條件下避光保存，避免反復凍融。

5.根據權利要求1所述的一種模擬IVIg的多人份混合人血漿IgG樣品的分離純化方法，其特征在于：所述純化方法中組分檢測步驟為樣品成品通過BCA、Elisa、Western?Blot、Coomassie?brilliant?blue?staining生化實驗檢測分析其組分，是否含有硫酸銨、精氨酸、枸櫞酸抗凝劑或其它成分，有各組份含量多少。

6.根據權利要求1所述的一種模擬IVIg的多人份混合人血漿IgG樣品的分離純化方法，其特征在于：所述純化方法中組分檢測步驟為使用BCA蛋白濃度測定法測定純化蛋白樣品的總蛋白濃度或通過Elisa法測定IgG濃度。