[發明專利]用于Sanger法的測序反應產物的變性方法

在審

• 申請號: 202011614154.1
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112553313A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 劉麗瓊;徐海霞;陳然;郝瑋;李小青
• 申請（專利權）人: 武漢康圣達醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明提供一種用于Sanger法的測序反應產物的變性方法，所述方法包括：向96孔板中的用于Sanger測序技術的測序反應產物中加入去離子水或去離子甲酰胺，然后將96孔板置于振蕩器上充分震蕩，振蕩后直接上機測序。本發明根據試劑HiDi的特性，利用實驗室現有的儀器改為震蕩后直接上機測序，減少了操作環節和高溫導致的有害氣體的產生，節省了操作時間以及不必要的人力物力的浪費。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種用于Sanger法的測序反應產物的變性方法。

背景技術

測序技術是分子生物學最重要的檢測手段，是基因多態性和基因突變檢測的金標準，也是其他眾多技術方法的參考標準。測序技術的優勢在于，直接測定樣本的基因序列，得到基因變異的精確情況，并且能夠對某一段DNA序列進行多位點突變檢測，或未知突變檢測，廣泛應用在腫瘤靶向藥物個體化治療檢測、遺傳疾病基因突變檢測、血液病基因突變檢測、HLA分型與配型、病原微生物耐藥性檢測等諸多領域。

第一代DNA測序技術是1975年由Sanger和Coulson開創的鏈終止法，或Maxam和Gilbert發明的化學法(鏈降解)。其中常用的Sanger測序(雙脫氧末端終止法)的原理是將被熒光標記的ddNTP摻入到dNTP中，由于ddNTP隨機摻入，PCR產物從引物之后的第一個堿基開始，每一個位置都有可能是ddNTP。由于ddNTP缺乏鏈延伸所需要的3'-OH，鏈的延伸就選擇性地在G、A、T或C處終止。這種PCR產物與普通PCR產物不同，不能形成一條電泳帶，而是一組長度相差一個堿基的成百上千種片段。它們具有共同的起始點，終止在不同的核苷酸上，每一個堿基都有相同的概率被終止。將不同大小的片段進行毛細管電泳，通過對熒光信號的采集和拼接，最終獲得目的片段的序列。其特點是高讀長；檢測通量中等；檢測靈敏度低；單孔成本低，適用于少數基因的少量位點測序，廣泛應用于臨床檢測和科學研究。DNA變性指DNA分子由穩定的雙螺旋結構松解為無規則線性結構的現象。變性時維持雙螺旋穩定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結構的改變，上機測序需要保持片段是單鏈，否則將嚴重影響測序質量。

目前常用方法是將測序反應產物在95℃變性3min，然后冷卻；需要使用PCR儀或者水浴鍋和冰塊，可能產生一些有害氣體，需要耗費較多的時間成本及人力成本等。因此，亟需對現有測序反應產物的變性方法進行改良。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于Sanger法的測序反應產物的變性方法。

為了實現本發明目的，本發明提供一種用于Sanger法的測序反應產物的變性方法，所述方法包括：向96孔板中的用于Sanger測序技術的測序反應產物中加入去離子水或去離子甲酰胺(HiDi)，然后將96孔板置于振蕩器上充分震蕩，振蕩后直接上機測序。

前述的方法，按照DNA與去離子水或去離子甲酰胺16-300ng:10-30μL的比例，向96孔板的各孔中加入去離子水或去離子甲酰胺。

可以根據峰圖的高低調整去離子水或去離子甲酰胺加入的量，10-30ulHiDi。一般地，擴增目的片段時人的DNA 16-100ng加入10μL HiDi。酶解純化的PCR產物3μL(測序反應時取0.8μL的酶解產物測序)，只需加入10μL HiDi，峰高(信號值)即可維持在1000左右，峰高≥500RFU為合格，低于100RFU無法辨認序列中的堿基。

前述的方法，各孔中的DNA為經過純化處理后自然晾干的DNA。

前述的方法，振蕩器的設置如下：轉速為780rpm左右，振幅為3mm左右，振蕩時間為5min左右。

前述的方法，測序反應產物的大小為20-600bp(信號比較清晰，信號值平均在500RFU以上)。

優選地，所述DNA來自于人類。