[發明專利]一種單分子熒光基因測序光學系統

有效

• 申請號: 202011612670.0
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN112646703B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 周文超;吳一輝;王越
• 申請（專利權）人: 中國科學院長春光學精密機械與物理研究所
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/6874;G01N21/64
• 代理公司: 長春中科長光知識產權代理事務所(普通合伙) 22218
• 代理人: 高一明;郭婷

本發明提供一種單分子熒光基因測序光學系統，為新型的基于頻率掃描的單分子實時測序技術，包括：測序芯片、多個用于激發熒光信號的單波長脈沖激光器組；脈沖激光器組的激發光依次通過激光光路照射到測序芯片上，對待測基因序列依次頻率掃描；再通過熒光光路進行光學成像，對修飾有不同熒光分子的核苷酸分子四種堿基磷酸段進行測序。采用脈沖激光掃描的照明方式可以有效降低激光光強對傳統三代單分子實時測序中連續照明對DNA聚合酶的光損傷，并且脈沖掃描時間選擇小于聚合延伸時間，因此在ATGC循環測序過程中后一個堿基開始檢測前，對前一個堿基的重復測量可以提高測序準確率。

技術領域

本發明涉及基因測序技術領域，具體涉及一種單分子熒光基因測序光學系統。

背景技術

基因測序技術是指識別特定DNA片段的堿基序列，即腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)的序列排列方式。目前基因測序市場主要以二代測序技術為主，典型代表為Illumina低、中、高測序平臺、Thermal Fisher公司的Ion Torrent測序平臺。相較于傳統一代測序方法，二代測序具有高通量低成本的突出特點，盡管準確度不如傳統測序方法，但是由于海量數據的分析，可以得到超出序列本身的信息，因此也是目前測序市場中的主流測序技術。但是由于擴增因而測序覆蓋度受GC組分影響，讀長較短不適合從頭組裝等研究。三代基因測序以單分子、長讀長、無PCR偏好性等位主要優勢，典型代表為PacBio的單分子熒光實時測序和Oxford公司的nanopore技術。PacBio公司的技術主要是利用零模波導納米孔技術提高信噪比實現對待測DNA片段的邊合成邊測序，nanopore技術主要是對DNA或RNA模板通過納米孔產生的電信號變化對堿基進行實時測序。前者由于檢測要求較高，設備成本和測序成本一直非常高，并且通量受限于目前已有的納米加工技術，后者結構簡單、測序讀長長，但是準確度相對較低。

發明內容

為了克服已有得技術問題，本發明提供了一種結構簡單，具有高時間分辨率、高空間分辨率的熒光測序光學系統。

為實現上述目的，本發明采用以下具體技術方案：

本發明提供一種單分子熒光基因測序光學系統，包括：測序芯片、用于激發熒光信號的單波長脈沖激光器組；所述脈沖激光器組激發四種不同波長的激光，依次通過激發光光路照射到測序芯片上，對單鏈聚合延伸過程中的核酸進行頻率掃描；再通過熒光光路進行光學成像。

優選地，還包括4-f光學系統，所述脈沖激光器組發射的激光經過所述4-f光學系統匯入所述激發光光路，保證光場均勻分布以及與測序芯片成像視場匹配。

優選地，所述脈沖激光器組發射的激光經過所述4-f光學系統照射到二向色性濾光片組件和反射鏡中，最長或最短波長的發射激光通過反射鏡進入光路系統中，其余波長的發射激光通過二向色性濾光片組件進入所述激發光光路中。

優選地，四種激發光通過一個四通道帶通濾光片并經一個成像物鏡照射到測序芯片上，激發產生的熒光信號通過該四通道帶通濾光片和后端成像系統進入測序圖像傳感器進行測序圖像傳感器成像。

優選地，所述四通道帶通濾光片傾斜45°安裝在光路中，同時實現不同熒光激發波長波段的反射與熒光發射波長波段的透射。

優選地，后端成像系統包括依次安裝在熒光光路上的準直透鏡組、后端濾光片、后端準直透鏡、筒鏡以及測序圖像傳感器；所述后端濾光片用于對背景噪聲進行濾波，后端成像系統用于對熒光信號進行測序圖像傳感器成像。

優選地，所述準直透鏡組中間加入一個針孔，該針孔設置在準直透鏡組的兩個透鏡的前后共焦點上，用于高頻濾光得到高質量圖像。

優選地，還包括：準直濾光片、準直透鏡以及準直圖像傳感器；所述準直濾光片平行于所述四通道帶通濾光片安裝在所述熒光光路上，通過所述準直濾光片和所述準直透鏡，將所述熒光光路上的部分熒光入射到所述準直圖像傳感器，用于對光路的校準。