[發(fā)明專利]一種聯(lián)合A群鏈球菌制劑和TLR8激動劑共刺激擴增CIK細(xì)胞的方法及其應(yīng)用

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• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112626016A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魏偉;嵐山芮;劉松
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州瑞鉑茵健康科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 張澤鋒

本發(fā)明公開了一種聯(lián)合A群鏈球菌制劑和TLR8激動劑共刺激擴增CIK細(xì)胞的方法及其應(yīng)用，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。所述的聯(lián)合A群鏈球菌制劑和TLR8激動劑共刺激擴增CIK細(xì)胞的方法，通過A群鏈球菌制劑和TLR8激動劑的組合來刺激擴增CIK細(xì)胞。本發(fā)明所述方法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞與常規(guī)方法培養(yǎng)制備的CIK細(xì)胞相比，利用A群鏈球菌制劑和TLR8激動劑作為刺激劑，直接激活CIK細(xì)胞，使獲得的CIK細(xì)胞具有數(shù)量大、純度高、細(xì)胞毒性強等特點，從而能夠滿足臨床的需要。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種聯(lián)合A群鏈球菌制劑和TLR8激動劑共刺激擴增CIK細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine induced killer cell，CIK)，是將單個核細(xì)胞經(jīng)多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)刺激后所獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，其同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，兼具T淋巴細(xì)胞強大的抗瘤活性和非主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性殺瘤的優(yōu)點。制備CIK使用的種子細(xì)胞來源包括外周血、臍帶血等，CIK細(xì)胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、對多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感、對正常骨髓造血前體細(xì)胞細(xì)胞毒性小等特點，是目前發(fā)現(xiàn)的殺傷腫瘤細(xì)胞活性強，適合于臨床應(yīng)用的一種理想的效應(yīng)細(xì)胞。

A群鏈球菌制劑為白色粉末，加生理氯化鈉溶液溶解后呈白色混濁液體，經(jīng)試驗證明具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞，激活宿主細(xì)胞免疫的功能，并可提高T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性；與化療合用可提高療效并可能有減輕化療藥對骨髓抑制的作用，可調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群使T3、T4、及T4/T8比值全面上升。

曾剛等人報道了A群鏈球菌制劑抗腫瘤效應(yīng)與細(xì)胞因子的關(guān)系，結(jié)果表明，A群鏈球菌制劑與腫瘤患者外周血淋巴細(xì)胞(PBL)共同孵育后，可增強PBL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，其上清液中亦均能檢測到較高水平的IL-12、IL-2、IFN-γ和TNF-α。

陳艷媛等人報道了TLR7激動劑增強人CIK細(xì)胞殺傷功能的研究，結(jié)果表明，TLR7激動劑(Tlr7a)具有增強CIK效應(yīng)細(xì)胞的擴增能力，其刺激后獲得的CIK細(xì)胞對K562腫瘤細(xì)胞的殺傷效果更好。

李旺等人報道了TLR7激動劑替代IFN－γ誘導(dǎo)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤的研究，結(jié)果表明，TLR7α通過刺激免疫細(xì)胞分泌多種免疫細(xì)胞因子及趨化因子，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-γ等，引發(fā)抗原呈遞細(xì)胞上的MNC分子和共刺激信號上調(diào)以及激活CIK，擴大免疫效應(yīng)。

專利CN104928241B公開了添加人CD3抗體和TLR7/8激動劑體外活化擴增的NK細(xì)胞的生物制劑，可在不與K562等腫瘤細(xì)胞混合的情況下安全且簡單有效地使NK細(xì)胞活化并增殖。

目前常用的技術(shù)主要是在體外培養(yǎng)體系中加入IL-2、IL-15、IFN-γ等多種細(xì)胞因子組合來促進CIK細(xì)胞的擴增，但經(jīng)過一段時間后擴增倍數(shù)和純度亦不夠理想，且殺傷活性亦不理想，導(dǎo)致不能完全滿足實際應(yīng)用的需求；而且這些已知方法由于對細(xì)胞因子的需求量較大、成本較高，培養(yǎng)效果不穩(wěn)定，不適合大規(guī)模的應(yīng)用。因此，亟需一種能夠顯著提高CIK細(xì)胞的免疫細(xì)胞活性和增殖能力的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種聯(lián)合A群鏈球菌制劑和TLR8激動劑共刺激擴增CIK細(xì)胞的方法。

本發(fā)明的第二個目的在于提供聯(lián)合A群鏈球菌制劑和TLR8激動劑共刺激擴增CIK細(xì)胞的方法的應(yīng)用。

本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種聯(lián)合A群鏈球菌制劑和TLR8激動劑共刺激擴增CIK細(xì)胞的方法，通過A群鏈球菌制劑和TLR8激動劑的組合來刺激擴增CIK細(xì)胞。

上述聯(lián)合A群鏈球菌制劑和TLR8激動劑共刺激擴增CIK細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

(1)采集血液，分離獲得單個核細(xì)胞；