[發明專利]一種牛奶體細胞分離過程優化工藝

在審

• 申請號: 202011609010.7
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112746055A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 郭勇慶;韓印如;鄧銘;柳廣斌;李耀坤;孫寶麗;劉德武;張家豪;魏子維
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/078;C12N15/10
• 代理公司: 南京金寧專利代理事務所(普通合伙) 32479
• 代理人: 林燕輝

本發明公開了一種牛奶體細胞分離過程優化工藝，涉及牛奶體細胞RNA提取技術領域；包括分離牛奶體細胞沉淀過程和RNA提取過程，所述分離牛奶體細胞沉淀過程，包括如下步驟：使用15mL離心管收集新鮮奶樣；每頭牛擠出的鮮奶分別裝至4個或若干個15ml離心管，1800r/10min/室溫離心；棄掉乳清和乳脂；所述RNA提取過程，包括如下步驟：采用AM1561試劑盒；將15ml離心管中的裂解物轉移至1.5ml離心管。本發明無需過濾或添加額外的試劑，當場分離牛奶體細胞，大大節省了時間，減少了不必要的操作，節省了時間，簡化了操作，使得牛奶體細胞沉淀分離過程，更迅速、簡單、方便。

技術領域

本發明涉及牛奶體細胞RNA提取技術領域，尤其涉及一種牛奶體細胞分離過程優化工藝。

背景技術

牛奶中的體細胞有兩個來源，一是來自乳腺分泌組織中的上皮細胞，也稱腺細胞；二是來自與炎癥進行搏斗時而死亡的白血細胞，腺細胞是正常的體細胞，是乳腺進行新陳代謝過程的產物，在奶中的含量相對恒定，而白細胞是一種防衛細胞，可以殺滅感染乳腺的病菌，還可以修復損傷的組織，因此白細胞在牛奶中的數量隨奶牛的生理狀態和健康水平有很大變化，而牛奶體細胞分離過程優化，是牛奶體細胞RNA提取過程的優化。

經檢索，中國專利申請號為CN201510188677.7的專利，公開了一種牛奶體細胞圖像分割方法，其包括以下步驟：獲取體細胞圖像，使用乳液樣本和熒光染色劑混合，將其放入特質的載玻片中并用激光照射，由于體細胞染色之后會發出紅光，再通過專業高清數碼攝像頭并進行濾波，使得只有熒光通過，得到基于RGB模型的體細胞圖像；利用得到的體細胞圖像并分析熒光透過的RGB分量，使用分量法對圖像進行灰度化處理，考慮細胞的灰度分布不均勻，僅采用圖像的R分量對細胞圖像進行灰度處理；對步驟二中得到的灰度圖像利用最大類間方差法對牛奶體細胞進行前景和背景的分割，得到二值化圖像I；在步驟三中得到的細胞分割圖像中會存在細胞的粘連問題，使用基于數學形態學的方法來處理細胞粘連情況，即對分割之后的圖像I進行腐蝕操作，最后得到以單個細胞為單連通域的二值化圖像。上述專利中的牛奶體細胞圖像分割方法存在以下不足：為獲得較多的體細胞數量，在早成擠奶后若干小時進行手動擠奶，且采集奶樣后需加EDTA、用紗布過濾等操作進行分離體細胞，較為繁瑣。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術中存在的缺點，而提出的一種牛奶體細胞分離過程優化工藝。

為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：

一種牛奶體細胞分離過程優化工藝，包括分離牛奶體細胞沉淀過程和RNA提取過程。

優選地：所述分離牛奶體細胞沉淀過程，包括如下步驟：

S1：使用15mL離心管收集新鮮奶樣；

S2：每頭牛擠出的鮮奶分別裝至4個或若干個15ml離心管， 1800r/10min/室溫離心；

S3：棄掉乳清和乳脂，每管用1-2ml PBS吹打混勻沉淀，此步之后也可全部轉移到同一個15mL離心管后再離心；

S4：1500r室溫離心5min，棄乳清和乳脂，盡量除去殘留乳脂，每管加400μL Trizol裂解液，靜置后帶回實驗室。

優選地：所述S4中Trizol裂解液的主要成分是苯酚，Trizol 在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。

優選地：所述S4中具體操作為，室溫靜置15分鐘后放入干冰，再帶回實驗室。

優選地：所述RNA提取過程，包括如下步驟：

S11：采用AM1561試劑盒；

S12：將15ml離心管中的裂解物轉移至1.5ml離心管；