[發明專利]具有特異性分子靶標的食源性致病菌標準菌株活菌的檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202011608299.0
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112538544B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 吳清平;張菊梅;丁郁;薛亮;陳謀通;相欣然;王涓;葉青華;吳詩;曾海燕;楊小鵑;張淑紅;龐銳;雷濤;古其會;韋獻虎;張友雄;陳魯
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）;廣東環凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/14;C12Q1/10;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文;周全英

1.用于檢測食源性致病菌的特異性分子靶標組合，其特征在于，所述特異性分子靶標組合的核苷酸序列見表格所示：

2.檢測如權利要求1所述的特異性分子靶標組合的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列見表格所示：

3.一種非診斷和治療目的檢測食源性致病菌活菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：在待測樣品加入PMA染料溶液；

步驟2：提取待測樣品中的菌體DNA；

步驟3：以步驟2中的菌體DNA為模板，進行實時熒光定量PCR檢測；

步驟4：待反應結束后，將獲得的熒光定量PCR擴增的曲線和Ct值與建立的標準曲線計算樣品中食源性致病菌活菌的數量；

其中，所述步驟3中進行實時熒光定量PCR檢測所使用如權利要求2所述的引物。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟3中實時熒光定量PCR檢測擴增的目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～14及SEQ ID NO：19～31所示。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟1所述待測樣品中的食源性致病菌菌體濃度控制在1×10⁴～1×10⁶cfu/mL范圍內。

6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟1具體操作如下：在待測樣品中加入PMA溶液，將其置于37℃恒溫培養箱中避光培養5min，用500W鎢絲燈照射10min，該步驟的目的是為了使死菌或細胞膜破損的菌的DNA與PMA交聯，使其不能進行PCR擴增。

7.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述PMA終濃度為2～16mg/mL。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述PMA終濃度為16mg/mL。

9.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟2待測樣品中的菌體DNA采用磁珠法提取菌懸液中的DNA。