[發(fā)明專利]一種非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011608096.1
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN112760416A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬光明;陳瑞愛;李延鵬;詹烜子;鐘偉鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市科豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44467
• 代理人: 羅嘯秋

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑、試劑盒及檢測方法。所述檢測試劑包括特異性引物A?F和A?R，以及探針A?P；所述探針的5′端標記熒光報告基團HEX，3′端標記熒光淬滅基團BHQ1。本發(fā)明的檢測試劑盒采用的特異性引物及探針序列短，擴增效率高、錯配幾率小，能夠顯著增強檢測效率、準確率和穩(wěn)定性；所建立的熒光PCR檢測方法敏感性高、特異性強。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑、試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是豬的一種高度接觸性傳染疾病，病死率可達100％，由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起與傳播。該病發(fā)展非常迅速，不到1個世紀的時間內(nèi)，從非洲開始席卷至近乎整個世界。ASF已是一種嚴重危害“世界經(jīng)濟”的動物疫病，也是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的A類動物疫病。

非洲豬瘟病毒是ASF樣病毒科的唯一成員，病毒粒子的直徑為175～215納米，呈20面體對稱，有囊膜，基因組為雙股線狀DNA，大小170～190kb。該病毒主要以巨噬細胞為感染靶細胞，并以其特有基因數(shù)量眾多、機制復雜的的病毒蛋白參與ASFV吸附、入侵宿主細胞、病毒復制與裝配、逃避宿主免疫防御系統(tǒng)等功能，使病毒能夠更有效地感染宿主細胞，引起豬的急性、熱性、出血性的臨床癥狀和病理損害。此外，非洲豬瘟存在復雜的感染循環(huán)方式，隱性感染豬以及受豬瘟病毒污染的生豬產(chǎn)品及其制品是非洲豬瘟引入健康地區(qū)豬群的重要傳播媒介，該病毒還可感染野豬和軟蜱，可在家豬與野豬之間、野豬與軟蜱之間以及家豬與軟蜱之間循環(huán)傳播。

目前，ASF尚無有效疫苗預防及治療方法，短期內(nèi)，依靠早期診斷與區(qū)域化防控管理來進行防制，采用嚴格的監(jiān)測計劃，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)采取大范圍撲殺方式切斷傳染源。OIE推薦的HAD、ELISA、IFA等血清學檢測方法，耗時長，操作復雜，不適用與非洲豬瘟病毒的快速檢測。實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR qPCR)具有操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復性好、污染率低的優(yōu)點，被廣泛應用于基因檢測領(lǐng)域。

專利CN 108300808 A公開了一種非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒、制備方法及使用方法。包括ASFV-反應液、DNA酶混合液、ASFV-內(nèi)標、ASFV-陽性對照、ASFV-陰性對照、核酸釋放劑以及ASFV-定量參考品，所述ASFV-反應液包括：引物：ASF03F03和ASF03R03；內(nèi)標引物：IPC05F01和IPC05R01；探針ASF03P和內(nèi)標探針I(yè)PC05P；所述引物和探針對應于非洲豬瘟病毒p72基因的高度保守片段。該專利采用引物ASF03F03和ASF03R03以及探針ASF03P具有優(yōu)良的敏感性與特異性，極大地減少了可能出現(xiàn)的因引物探針錯配導致的漏檢。配合內(nèi)標引物IPC05F01和IPC05R01以及內(nèi)標探針I(yè)PC05P可以監(jiān)測整個PCR反應體系是否正常，從而避免因使用不當造成的錯誤的判定結(jié)果。

專利CN 109593893 A公開了一種非洲豬瘟病毒熒光PCR快速檢測試劑盒，包括特異性引物ASFV-F和ASFV-R，以及TaqMan探針ASFV-P，探針的5′端標記報告熒光染料為HEX，3′端標記熒光淬滅基團為BHQ-1。該發(fā)明選取非洲豬瘟病毒高度保守的p72基因(編碼B646L結(jié)構(gòu)蛋白)作為靶基因，設(shè)計特異性引物及探針建立ASFV特異的熒光PCR檢測方法。

上述檢測試劑盒所采用的引物及探針雖然均是以非洲豬瘟病毒高度保守的p72基因作為靶基因，具有良好的特異性。但相應的擴增效率、檢測準確率及穩(wěn)定性仍有進一步改進的空間。

發(fā)明內(nèi)容

針對以上現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒。

本發(fā)明的又一目的在于提供上述非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒的制備方法。