[發明專利]自共焦近紅外二區熒光壽命顯微鏡

有效

• 申請號: 202011607103.6
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112835189B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 錢駿;周靜
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00;G01N21/64
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 忻明年

本發明公開了一種自共焦近紅外二區熒光壽命顯微鏡。本發明中激光光源出射后被分成兩路，一路被光電二極管接收，經光電轉換后傳輸至計數板卡，用來采集激發光脈沖信號；另一路經過準直透鏡組被準直后透過二色鏡，被第一透鏡聚焦在小孔上，再經過第二透鏡變成準直光，然后經過掃描振鏡、掃描透鏡和套筒透鏡后，被物鏡聚焦于樣品上。聚焦點發出的近紅外二區熒光信號按逆入射光路的方向傳輸，再次被聚焦于小孔上，然后被二色鏡反射，經收集模塊傳輸至光電倍增管轉換成電信號，電信號再轉換成電計數信號輸入到計數板卡。熒光信號和激發光脈沖信號經處理后，得到樣品的近紅外二區熒光壽命共聚焦圖像。本發明光路調節過程可控、穩定又簡便。

技術領域

本發明屬于應用光學的顯微成像領域，涉及一種共聚焦近紅外二區熒光壽命顯微成像系統。

背景技術

一、基于單光子激發的共聚焦近紅外二區熒光壽命顯微成像

根據生物組織窗口的相關理論，近紅外二區（NIR-II，900-1700 nm）光相比于可見光和近紅外一區（NIR-I，780-900 nm）光，其在生物組織中散射更小，且組織在這一波段的自發熒光很弱，因此在成像上可以實現更高的空間分辨率和信背比，以及更大的穿透深度。近紅外二區已成為生物成像中非常吸引人的一個光學窗口。

近紅外二區熒光成像系統從照明方式上可分為寬場照明和點掃描兩大類。采取寬場照明的有近紅外二區熒光宏觀成像系統和近紅外二區熒光寬場顯微成像系統。近紅外二區熒光宏觀成像系統目前已實現商用化，可以實現大視野實時成像（如整只小鼠）。近紅外二區熒光寬場顯微成像系統則可以對小視野進行高放大倍數的實時成像。但是這兩種系統的成像景深比較大，信背比和分辨率不夠高。而采取點掃描激發的多光子近紅外二區熒光掃描成像系統和共聚焦近紅外二區熒光掃描成像系統則可以實現小景深、高信背比和高分辨率的成像。因共聚焦成像利用的是材料在單光子激發下產生的熒光信號，比多光子成像效率更高，故申請人將其與時間相關單光子計數(TCSPC)技術結合，在先前開發出了共聚焦近紅外二區熒光壽命顯微成像系統來對樣品進行多功能成像（熒光強度+熒光壽命）。但是之前系統的光路調節過程復雜且對光路的穩定性要求很高，為了解決這個問題并維持飛秒光的窄脈寬，本發明對光路進行了創新，能夠實現全空間光下的自動共聚焦，該光路調節過程可控、穩定且簡便。

二、時間相關單光子計數—— TCSPC（Time-Correlated Single PhotonCounting）

TCSPC技術用于熒光壽命測量的原理如下：在激發光的一個脈沖周期內，當熒光信號很微弱且探測器探測頻率很高時，有的探測周期內可能探測不到光子，有的探測周期內能夠探測到一個光子，將光子被探測到的時間對應到脈沖周期內的某個時間段，這樣在對多個激發光脈沖周期內的熒光光子進行重復測量后，對各時間段內的光子數目進行統計就能得到光子隨時間變化的頻率分布直方圖，對直方圖進行擬合即可獲得光信號隨時間的強度變化，從而得到熒光壽命。

將TCSPC技術用于激光掃描顯微成像系統，通過獲得每個像素點的熒光壽命信息，構建出熒光壽命圖像。此外，每個像素點上累積的光子數能代表該像素的總體光強度，于是熒光強度圖也可以被重構出來。

發明內容

本發明為解決現有技術光路調節繁復的難點，提出了一種自動共聚焦近紅外二區熒光壽命顯微成像系統。

本發明的主要技術構思：

本發明以奧林巴斯的掃描顯微鏡（FV1200）為基礎光學系統，在其上添加自共焦模塊，并結合飛秒脈沖激光光源、近紅外二區響應的光電倍增管（H12397-75）及TCSPC計數板卡（Becker Hickl SPC-150），開發出一套能在單光子激發下實現自動共聚焦的近紅外二區熒光壽命顯微成像系統。本發明將800 nm飛秒脈沖激光引入系統激發熒光探針，截取其900～1700nm波段熒光信號的光子進行探測，既獲取了材料的近紅外二區熒光壽命圖像，又得到了材料的近紅外二區熒光強度圖像。

本發明的技術方案：