[發(fā)明專利]抗非洲豬瘟病毒p54蛋白單克隆抗體、制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011607066.9
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112552396B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳玉梅;王愛萍;蔣敏;趙建國;馮景;石海寧;趙孟孟
• 申請（專利權(quán)）人: 河南中澤生物工程有限公司
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C12N15/13;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 鄭州睿信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

本發(fā)明涉及抗非洲豬瘟病毒p54蛋白單克隆抗體、制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成能夠模擬保守性p54蛋白NTD的多肽，并將其與BSA偶聯(lián)作為免疫原，通過免疫學(xué)方法免疫BALB/c小鼠制備獲得抗ASFVp54蛋白單克隆抗體，該抗體能夠特異性的識別并結(jié)合p54蛋白的N端區(qū)域，該識別區(qū)域(aa 1?29)區(qū)別于現(xiàn)有商品化單抗。本發(fā)明提供了上述抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)基因序列，在此基礎(chǔ)上，可以采用常規(guī)基因工程或蛋白質(zhì)工程方法獲得本發(fā)明的單克隆抗體。該單克隆抗體特異性強(qiáng)，靈敏度高，能與ASFV HLJ/18株病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，而與CSFV、PCV2、PRRSV、PEDV及PRV等豬源病毒不發(fā)生反應(yīng)，為進(jìn)行ASFV病原學(xué)和致病機(jī)理的研究及ASFV病原的臨床檢測研究奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗非洲豬瘟病毒p54蛋白單克隆抗體、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

非洲豬瘟病毒(ASFV)是一種巨大而復(fù)雜的DNA病毒，是非洲豬瘟(ASF)的病原體，是Asfarviridae屬的唯一已知的成員。ASF是家豬中高度傳染性的出血性疾病，其發(fā)病率和死亡率高達(dá)100％。ASFV最早于1921年在肯尼亞被發(fā)現(xiàn)，距現(xiàn)在已近一個(gè)世紀(jì)。自2007年傳播到佐治亞州以來，ASFV已迅速傳播遍布非洲，亞洲和歐洲的多個(gè)國家，并在這些地區(qū)循環(huán)爆發(fā)。同時(shí)，ASFV具有多個(gè)天然宿主和貯存庫，這進(jìn)一步加大了ASF的潛在威脅性。鑒于這種跨界動(dòng)物疾病的巨大風(fēng)險(xiǎn)和威脅，它已被列入世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典，且被定為必須向OIE報(bào)告的動(dòng)物疾病。

由于ASFV在全球范圍內(nèi)的經(jīng)濟(jì)重要性，自1960年代末以來，一直在嘗試開發(fā)一種有效，安全的疫苗來保護(hù)豬免受ASFV感染。然而，由于ASFV的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和對病毒蛋白功能的了解有限，世界上尚未開發(fā)出針對ASF的安全有效的疫苗，對非洲豬瘟的控制嚴(yán)格依賴于動(dòng)物檢疫。因此，對ASFV的檢測及防控至關(guān)重要。

ASFV擁有170-194kb的大型線性雙鏈DNA(dsDNA)基因組，編碼150多種蛋白質(zhì)。盡管已經(jīng)從病毒體中鑒定出多達(dá)68種結(jié)構(gòu)蛋白，但大多數(shù)蛋白的功能尚不清楚。ASFV病毒體具有獨(dú)特的多層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)病毒體由核苷(第一層)，內(nèi)核殼(第二層)，內(nèi)膜(第三層)和衣殼(第四層)構(gòu)成。細(xì)胞外病毒體具有額外的外部包膜(第五層)。細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外ASFV病毒體都具有傳染性。構(gòu)成病毒顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白分布在這些多層結(jié)構(gòu)中，并在病毒感染中發(fā)揮各種作用。病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原特性的鑒定對于理解病毒與宿主之間的相互作用是必不可少的，對于改進(jìn)ASFV血清學(xué)診斷和設(shè)計(jì)亞單位疫苗或病毒載體疫苗是至關(guān)重要的。目前，ASFV具有25個(gè)基因型，某些基因的遺傳多樣性和抗原多樣性是造成缺乏針對這種致死性豬疾病的交叉保護(hù)疫苗這種情況的主要原因之一。抗原性結(jié)構(gòu)蛋白的多樣性也可能會(huì)對ASFV感染的可靠診斷產(chǎn)生巨大影響。

為了深入研究抗原性結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染中發(fā)揮的作用，并實(shí)現(xiàn)對ASFV病毒感染的準(zhǔn)確診斷，本領(lǐng)域仍需要更多能夠識別ASFV不同結(jié)構(gòu)蛋白、不同抗原表位的單克隆抗體，為防治ASF提供新方向和新思路。非洲豬瘟病毒p54蛋白的編碼序列在不同毒株間具有多態(tài)性，但其N端區(qū)域(NTD)在各毒株間相對保守，且在病毒形態(tài)形成以及入侵等過程中具有重要作用。然而，現(xiàn)有技術(shù)和報(bào)道中還未見有特異性針對NTD的單克隆抗體。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成能夠模擬p54蛋白NTD的多肽，并將其與BSA偶聯(lián)作為免疫原，以期獲得特異性識別p54蛋白NTD的單克隆抗體，為進(jìn)一步的研究抗原性結(jié)構(gòu)蛋白p54特性以及不同結(jié)構(gòu)域的功能提供工具，為ASF的防控提供新方向和新思路。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供抗非洲豬瘟病毒p54蛋白單克隆抗體，該單克隆抗體能夠特異性識別非洲豬瘟病毒p54蛋白上的N端區(qū)域(aa 1-29)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供非洲豬瘟病毒p54蛋白單克隆抗體的制備方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供非洲豬瘟病毒p54蛋白單克隆抗體的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：