[發明專利]一種基于宏基因組學的呼吸道咽拭子樣本的建庫方法和病原檢測方法

有效

• 申請號: 202011606303.X
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112646859B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 李鵬;宋宏彬;林彥鋒;王凱英;李瑾慧;楊朗;李沛翰;賈雷立
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C12Q1/6869;C12Q1/689;C12Q1/70;C40B40/06;C40B50/06
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 王煥

本發明提供了一種基于宏基因組學的呼吸道咽拭子樣本的建庫方法和病原檢測方法，涉及微生物檢測技術領域。所述建庫方法包括(a)待測樣本溶液預處理：加入溶菌酶進行消化；(b)樣本總核酸的提取，在提取的過程中不添加carrier RNA；(c)cDNA合成：采用隨機引物進行反轉錄；(d)使用磁珠對步驟(c)合成的產物進行純化；(e)樣本DNA文庫的構建。本發明基于DNA?RNA共測序原理，提供了一種基于宏基因組學的適合于咽拭子樣本建庫與檢測的方法，通過單次反應就能實現咽拭子樣本宏基因組的病原檢測。

技術領域

本發明涉及技術領域，尤其是涉及一種基于宏基因組學的呼吸道咽拭子樣本的建庫方法和病原檢測方法。

背景技術

引起呼吸道感染的病原種類多樣，包括病毒、細菌、真菌等，其中大部分病原以DNA為遺傳信息的載體，但是也有一部分病毒(如流感病毒、冠狀病毒等)以RNA為遺傳信息的載體。呼吸道臨床樣本的宏基因組測序目前已成為一種呼吸道感染病原檢測的重要方法，它通過直接對樣本中所有微生物核酸進行檢測，不僅可以同時檢測樣本中存在的多種病原，也可發現一些常規方法難以識別的新發或罕見病原。由于針對DNA或RNA的測序方法上存在一些差異，目前常規的宏基因組病原檢測的測序建庫方法，會根據臨床醫生對感染病原的經驗判斷，選擇主要針對細菌檢測的DNA建庫、主要針對病毒檢測的RNA建庫，或者同時做DNA和RNA兩次建庫。然而實際工作中很多病例可能無法根據經驗判斷引起感染的病原是細菌、病毒或其他種類病原，而且一旦選擇了錯誤的建庫方法可能導致病原的漏檢。另一方面，咽拭子是一種常規的無創的呼吸道樣本，常用于呼吸道病原檢測，但是樣本中的核酸含量一般較少，如果選擇同時進行DNA與RNA進行2次建庫，不僅增加了檢測時間與成本，而且核酸含量一般也難以滿足2次建庫。因此，開發一種單次反應就能實現咽拭子樣本宏基因組病原檢測的方法就十分有必要。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于宏基因組學的呼吸道咽拭子樣本病原檢測方法。本發明基于DNA-RNA共測序原理，提供了一種基于宏基因組學的適合于咽拭子樣本建庫與檢測的方法，通過單次反應就能實現咽拭子樣本宏基因組的病原檢測。

本發明提供的技術方案如下：

一方面，本發明提供了一種基于宏基因組學的呼吸道咽拭子樣本的建庫方法，所述方法包括：

(a)待測樣本溶液預處理：加入溶菌酶進行消化；

(b)樣本總核酸的提取，在提取的過程中不添加carrier RNA；

(c)cDNA合成：采用隨機引物進行反轉錄；

(d)使用磁珠對步驟(c)合成的產物進行純化；

(e)樣本DNA文庫的構建。

本發明考慮到在咽拭子樣本溶液的處理中，需要兼顧咽拭子樣本中可能存在的革蘭氏陽性菌等難以裂解的病原，因此在核酸提取前加入溶菌酶消化的步驟，可以提高核酸提取效率。

采集咽拭子樣本，并制備待測樣本溶液(咽拭子樣本液化)；在待測樣本溶液中加入溶菌酶進行消化。

在一個實施方案中，所述方法在步驟(a)中，所述溶菌酶的加入量為所述待測樣本溶液體積的1/50，所述溶菌酶的濃度為50mg/mL。

在一個實施方案中，所述方法在步驟(a)中，加入溶菌酶后，充分混勻，于37℃孵育15min。