[發(fā)明專利]一種提高絲狀真菌蛋白分泌水平的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011604138.4
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN114686509A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發(fā)明（設計）人: 馬延和;王興吉;田朝光;郭慶文;劉倩;劉文龍;劉音;李金根;劉丹丹;郭文柱;武敏;孫濤;孫文良
• 申請（專利權(quán)）人: 山東隆科特酶制劑有限公司;中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/31;C12N1/15;C12P19/14;C12P19/02;C12R1/685
• 代理公司: 北京商專永信知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 歐陽石文

本發(fā)明公開了一種提高曲霉分泌蛋白的方法及所述方法獲得的重組菌株。所述方法包括對曲霉細胞進行遺傳操作以缺失或降低特定基因的活性，以提高其糖化酶、α?淀粉酶、其它參與淀粉水解的蛋白質(zhì)等蛋白分泌能力。在一個具體實驗中，本發(fā)明利用CRISPR?Cas9編輯技術(shù)敲除黑曲霉基因An01g09210，得到基因編輯缺失突變菌株，該突變菌株能夠顯著提升淀粉水解酶的生產(chǎn)水平，其中蛋白分泌水平比出發(fā)菌株提高約33％，糖化酶的活力比出發(fā)菌提高約36％，α?淀粉酶的活力比出發(fā)菌提高約24％，具有較大的應用價值。

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于基因工程和生物技術(shù)領域。具體地，本發(fā)明涉及一種提高曲霉蛋白分泌水平的方法，具體涉及曲霉的遺傳改造，更具體的涉及對曲霉基因組進行基因An01g09210的缺失編輯。

背景技術(shù)

絲狀真菌蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)發(fā)展?jié)摿薮蟆?a title="鉆瓜專利網(wǎng)">專利前景廣闊，它作為細胞工廠可高效表達分泌胞外蛋白，生產(chǎn)有價值的產(chǎn)品(例如工業(yè)酶和有機酸等)。許多絲狀真菌例如黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)和里氏木霉(Trichodermareesei)等已經(jīng)得到FDA(食品藥品監(jiān)督管理局)認證，被國際普遍認定為安全菌(GenerallyRecognized As Safe，GRAS)，而被廣泛用于工業(yè)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。

糖化酶(Glucoamylase，EC 3.2.1.3)全稱為葡萄糖淀粉酶，廣泛應用于啤酒、味精、淀粉糖、抗菌素等要求淀粉最大限度轉(zhuǎn)化為葡萄糖的工業(yè)領域，是工業(yè)生產(chǎn)中最重要的酶類之一。糖化酶的主要生產(chǎn)菌種為霉菌，我國多用黑曲霉、紅曲霉以及根霉。我國糖化酶主要是由黑曲霉優(yōu)良菌種經(jīng)深層發(fā)酵精制提煉而成。我國淀粉加工用酶行業(yè)經(jīng)過幾十年的不斷發(fā)展，目前已經(jīng)可以自主生產(chǎn)糖化酶等大宗酶制劑品種，例如中國專利CN105255741A公布了一株以黑曲霉G131和F285為出發(fā)菌株，通過多輪原生質(zhì)體電融合育種選育獲得的高產(chǎn)糖化酶的菌株-黑曲霉CGMCC 10788，該菌株平均發(fā)酵酶活力可達到87000-90000u/mL，比出發(fā)菌株提高了99.3％；專利號為CN 105969675 A的發(fā)明專利公開了一株高產(chǎn)糖化酶的黑曲酶菌株，該突變株通過失活α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的表達從而提高糖化酶的酶活；專利號為CN103937766 A的發(fā)明專利公開了一種通過將糖化酶表達盒和選擇標記基因定點整合到黑曲霉An12g08830基因座，從而提高糖化酶的方法。

盡管這些研究也已經(jīng)達到了很高的水平，但是目前的研究主要集中在利用傳統(tǒng)的菌種選育方法進行高產(chǎn)糖化酶菌株的篩選育種，或者是在原有的黑曲霉菌株中提高糖化酶基因的拷貝數(shù)或者去除轉(zhuǎn)苷酶。糖化酶合成分泌涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，翻譯，折疊修飾，轉(zhuǎn)運，分泌出細胞膜等多個系統(tǒng)，是一個非常復雜的過程。但是，糖化酶高產(chǎn)菌株不僅要在表達水平上提高糖化酶基因的RNA豐度，還需要我們進一步了解糖化酶在分泌過程中的效應，減輕甚至消除分泌途徑的瓶頸，進一步提高絲狀真菌蛋白分泌能力。

因此，有必要開發(fā)一種通過改造分泌途徑來提高蛋白分泌水平的方法，并利用基因編輯技術(shù)獲得糖化酶等淀粉水解酶分泌水平顯著提高的重組菌株，從而降低傳統(tǒng)篩選育種所需耗費大量時間和勞動成本，以滿足我國糖化酶在工業(yè)領域進行發(fā)酵應用，具有重要的創(chuàng)新性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，目的在于提供一種能夠提高絲狀真菌產(chǎn)淀粉酶生產(chǎn)能力和蛋白分泌水平的菌種改造方法，是通過遺傳改造絲狀真菌蛋白分泌途徑相關基因來提高絲狀真菌淀粉酶產(chǎn)量和蛋白分泌水平。本發(fā)明通過CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)對黑曲霉菌株基因An01g09210進行敲除編輯，獲得了基因An01g09210缺失重組菌株，該重組菌株能夠顯著提升蛋白的分泌水平，顯著提高糖化酶和α-淀粉酶的生產(chǎn)能力和酶活水平。

為達到此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：