[發明專利]一種HB-NC4重組蛋白及其制備方法與應用在審
| 申請號： | 202011602310.2 | 申請日： | 2020-12-29 |
| 公開（公告）號： | CN113024675A | 公開（公告）日： | 2021-06-25 |
| 發明（設計）人： | 李妍;汪亞婭;王福文;李連;牟艷玲 | 申請（專利權）人： | 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院） |
| 主分類號： | C07K19/00 | 分類號： | C07K19/00;C12N15/70;A61K38/18;A61K38/39;A61P19/02;A61P29/00 |
| 代理公司： | 濟南信達專利事務所有限公司 37100 | 代理人： | 羅文曌;劉凱 |
| 地址： | 250117 山東*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 hb nc4 重組 蛋白 及其 制備 方法 應用 | ||
1.一種HB-NC4重組蛋白，其特征在于該重組蛋白是由NC4人源膠原蛋白IX的N末端非膠原結構域4、HB肝素結合結構域重組構成。
2.一種HB-NC4重組蛋白，其特征在于：該重組蛋白的氨基酸殘基序列如SEQ ID NO.1。
3.一種HB-NC4重組蛋白，其特征在于：帶有His標簽的該重組蛋白氨基酸殘基序列如SEQ ID NO.2。
4.一種HB-NC4重組蛋白，其特征在于：編碼該重組蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，或其具有遺傳密碼簡并性的序列。
5.根據權利要求4所述的一種HB-NC4重組蛋白，其特征在于：編碼該重組蛋白的核苷酸序列中，
編碼肝素結合結構域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4，或其具有遺傳密碼簡并性的序列；
編碼的人源膠原蛋白IX的N末端非膠原結構域4的核苷酸序列如SEQ ID NO.5，或其具有遺傳密碼簡并性的序列。
6.一種重組質粒，其特征在于：該質粒的核苷酸序列包含有如權利要求4所述的一種HB-NC4重組蛋白的核苷酸序列。
7.一種如權利要求1～4所述HB-NC4融合蛋白的制備方法，其特征在于：
(1)融合基因的構建：制備含有編碼NC4的目的基因和編碼HB的目的基因的HB-NC4融合基因，并擴增；
(2)采用限制性內切酶Bam HⅠ、XhoⅠ分別酶切質粒pET28a，并回收酶切產物，采用重組克隆試劑盒連接酶切質粒和HB-NC4融合基因；
(3)將步驟(2)的連接產物轉化入大腸桿菌DH5a感受態細胞，篩選陽性克隆并用PCR及DNA測序分析鑒定重組質粒pET28a/HB-NC4，并獲得最終重組表達質粒pET28a/HB-NC4；
(4)采用熱激法將表達質粒轉化入大腸桿菌感受態細胞中，在含有硫酸卡那霉素的LB平板上培養，篩選轉化子單菌落并抽提質粒進行PCR驗證，獲得陽性轉化子；
(5)將上述陽性轉化子發酵，分離純化得到發酵產物，鑒定發酵產物即為pET-HB-NC4重組蛋白。
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