[發明專利]基于卵巢或陰道脫細胞基質的3D打印復合生物墨水的制備方法及應用

在審

• 申請號: 202011601206.1
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112755248A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 黃向華;張敬坤;鄭嘉華;侯晨曉
• 申請（專利權）人: 河北醫科大學第二醫院
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/20;A61L27/22;A61L27/38;B33Y70/10
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司 13112
• 代理人: 張莉靜

1.一種基于卵巢或陰道脫細胞基質的3D打印復合生物墨水的制備方法，其特征是，包括以下步驟：

a、將預先制備的卵巢或陰道脫細胞基質粉末加入到胃蛋白酶溶液中進行消化，得到質量分數為3.0~3.5%的脫細胞基質溶液；其中，所述胃蛋白酶溶液的濃度為18~22 mg/mL；

b、在所得的脫細胞基質溶液中滴加堿液，使pH為7.0-7.3，從而得到流動態的脫細胞基質溶液；

c、制備明膠和海藻酸鈉的混合膠溶液，其中，明膠的質量分數為13~17%，海藻酸鈉的質量分數為2~4%；

d、將步驟c所得的明膠和海藻酸鈉混合膠溶液加入到經步驟b處理的脫細胞基質溶液中，混合均勻后即得到所述復合生物墨水，其中，混合膠溶液與脫細胞基質溶液的體積比為1~3∶3。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是，步驟a中，所述卵巢脫細胞基質粉末通過以下方法制備：

（1）機械處理：取新鮮的豬/牛/人卵巢組織，去除卵巢周圍組織，并將卵巢組織剪成組織塊，用冷生理鹽水沖洗；

（2）低滲溶液處理：將卵巢組織置于3~5℃含苯甲基磺酰氟的去離子水中，震蕩處理36~60h，且每12 h換液一次；

（3）離子型洗滌劑處理：將經步驟（2）處理的卵巢組織置于pH為 7.8~8.2、溫度為3~5℃的含苯甲基磺酰氟和十二烷基硫酸鈉的Tris-HCl 溶液中，震蕩處理10~14h，然后依次用PBS溶液和去離子水進行清洗；

（4）非離子型洗滌劑處理：將經步驟（3）處理的卵巢組織置于pH為 7.8~8.2、溫度為3~5℃的含苯甲基磺酰氟和Triton X-100的Tris-HCl 溶液中，震蕩處理6~8d，并每12h換液一次；然后依次用PBS溶液和去離子水進行清洗；

（5）酶處理：將經步驟（4）處理的卵巢組織置于pH為 7.3~7.6、溫度為35~38℃的含脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的Tris-HCl 溶液中，震蕩處理12~13h，然后依次用PBS溶液和去離子水進行清洗；

（6）打孔：將經步驟（5）處理后的卵巢組織置于溫度為3~5℃、質量分數為4~6%的過氧乙酸溶液中，震蕩處理1.5~2.5h，然后依次用PBS溶液和去離子水進行清洗；

（7）將經步驟（6）處理后的卵巢組織消毒后凍干，凍干塊經研磨即得卵巢脫細胞基質粉末。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是，步驟a中，所述胃蛋白酶溶液用0.01mol/L的鹽酸溶液配制而成，消化處理為：在37℃下震蕩處理24~26h。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是，步驟b中，所述堿液為0.1mM NaOH溶液。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是，步驟c中，混合膠溶液的配制過程為：將稱取的明膠和海藻酸鈉置于無菌去離子水溶液中，并于50~55℃融溶混合20~40min。

6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是，步驟d中，明膠和海藻酸鈉混合膠溶液與脫細胞基質溶液的體積比為2∶3。

7.一種權利要求1~6制備的任一復合生物墨水在3D生物打印人造卵巢或人造陰道中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征是，將復合生物墨水經巴氏消毒后包裹種子細胞，然后置于無菌打印料筒中，3~5℃控溫10~20min，之后裝入3D打印噴頭內，設置噴頭溫度18~22℃，平臺3~5℃控溫5-20min，模型導入，并進行參數設置，開始進行3D打印，打印完成后，用5%CaCl₂交聯5~10min，使打印物成型穩定。