[發明專利]APEC雙sRNA基因缺失菌株及由其制備的弱毒疫苗

在審

• 申請號: 202011597050.4
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN112695005A
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 諸葛祥凱;戴建君;姜敏;周洲;王忠星
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;A61K39/108;A61P31/04;C12R1/19
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本發明公開了一株APEC雙sRNA基因缺失菌株及由其制備的弱毒疫苗，APEC雙sRNA基因缺失菌株的構建方法為Red同源重組方法對RyhA和GcvB雙sRNA基因進行敲除，得到禽致病性大腸桿菌FY26ΔryhA/gcvB，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCC M 2020611。本發明缺失株具有很好的生物安全性和免疫原性，且毒性較弱，可用于制備禽致病性大腸桿菌弱毒疫苗，預防禽致病性性大腸桿菌感染。本發明禽致病性大腸桿菌FY26ΔryhA/gcvB制備的弱毒疫苗，針對禽致病性大腸桿菌感染具有免疫保護力，攻毒免疫保護效果好。

技術領域

本發明屬于微生物領域，具體涉及一株APEC雙sRNA基因缺失菌株及由其制備的弱毒疫苗，尤其涉 及一株禽致病性大腸桿菌RyhA和GcvB雙sRNA基因缺失菌株及由其制備的弱毒疫苗。

背景技術

禽致病性大腸桿菌(APEC)主要通過呼吸道感染禽類，致病力較強的APEC病原可以突破肺臟的免 疫防御進入血液，引起敗血癥，從而導致禽類的多系統混合感染，甚至引起禽急性死亡。隨著我國養禽業 的發展，禽大腸桿菌病已成為危害養禽業最嚴重的細菌性傳染病之一，該病的發病率為11％-69％，死亡率 為3.8％-72.9％，對養禽業造成巨大損失，對食品安全構成極大威脅。目前APEC的致病機制尚未闡明，且 無有效的疫苗防疫禽大腸桿菌病，僅依靠抗生素等藥物控制禽大腸桿菌病，導致APEC分離株耐藥性不斷 增加及禽產品存在藥物殘留的風險。

近年來，研究發現致病菌毒力因子的表達調控同樣發生在mRNA翻譯水平，這種調控被稱為轉錄后調 控(Post-transcriptional Regulation)，而操縱轉錄后調控的元件是一類小的非編碼調控性RNA(Small Non-coding Regulatory RNAs)，簡稱sRNA。sRNA作為轉錄后調節分子普遍發現于原核生命體，不同種類 的sRNA堿基長度多樣，但長度范圍普遍在50bp至500bp之間。sRNA往往與細菌致病力直接相關，一些 新發現的sRNA參與致病菌在感染狀態下的壓力應答。調控性sRNA與致病菌一系列致病代謝基因表達密 切相關。研究指出，sRNA RyhA能轉錄后調控大腸桿菌氨基酸代謝，其能調節芳香族氨基酸合成相關基因的表達。sRNA GcvB同樣能夠調控大腸桿菌氨基酸代謝和轉運。盡管傳統的滅活疫苗和亞單位疫苗一直在 沿用，但由于免疫效果不佳，免疫途徑不方便而逐漸被弱毒活疫苗所取代。制約弱毒疫苗研制的一個關鍵 因素是缺少具有良好免疫原性、毒力低的疫苗株。因此篩選合適的毒力基因，對菌株毒力進行致弱、減毒 是獲得疫苗株的技術手段備受關注。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一株免疫原性好和安全性強的禽致病性大腸桿菌RyhA和GcvB雙 sRNA基因缺失菌株及其制備的弱毒疫苗，以達到安全預防禽大腸桿菌病的作用。

為了實現上述目的，本發明使用了如下技術方案：

一株APEC雙sRNA基因缺失菌株，所述APEC雙sRNA基因缺失菌株為禽致病性大腸桿菌RyhA和 GcvB雙sRNA基因缺失株FY26ΔryhA/gcvB，保藏在中國典型培養物保藏中心，地址為中國武漢武漢大學， 保藏編號為CCTCC M 2020611，保藏日期為2020年10月20日，分類命名為Escherichia coli大腸桿菌。

進一步的，所述APEC雙sRNA基因缺失菌株的構建方法為：采用Red同源重組的方法對所述禽致病 性大腸桿菌FY26中的RyhA和GcvB雙sRNA基因逐一進行敲除，得到所述禽致病性大腸桿菌RyhA和 GcvB雙sRNA基因缺失株FY26ΔryhA/gcvB。

進一步的，本發明還提供了一種上述的APEC雙sRNA基因缺失菌株在制備防治禽大腸桿菌病的禽致 病性大腸桿菌弱毒疫苗中的應用。

進一步的，本發明還提供了一種上述的APEC雙sRNA基因缺失菌株制備得到的禽致病性大腸桿菌弱 毒疫苗。