[發明專利]檢測2019-nCoV的試劑、試劑盒及應用

有效

• 申請號: 202011593767.1
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN112553378B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 丘力功;陳宋彬;郝宇;李潤明;倪世明;羅春;趙海蓮;符美娟
• 申請（專利權）人: 廣州白云山拜迪生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

1.一種試劑，包含擴增引物對和crRNA；

所述擴增引物對用于擴增2019-nCoV ORF1ab基因特定片段；

所述2019-nCoV ORF1ab基因特定片段的序列如2019-nCoV基因的第13302～13396位核苷酸序列所示；

所述2019-nCoV基因的登錄號為MW281864.1；

所述擴增引物對包括正向引物和反向引物；

所述反向引物包含T7啟動子序列；

所述crRNA包含錨定序列和向導序列，所述錨定序列與Cas蛋白特異性識別，所述向導序列與所述2019-nCoV ORF1ab基因特定片段的負鏈特異性識別；

所述擴增引物對的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

所述crRNA的序列如SEQ ID NO.13所示。

2.權利要求1所述的試劑在制備COVID-19診斷和/或預后評估的產品中的應用。

3.一種試劑盒，其特征在于：包含權利要求1所述的試劑。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括Cas蛋白、信號報告探針。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：

所述Cas蛋白為Cas13a；

所述信號報告探針包含核酸序列，所述核酸序列的5’端標記熒光報告基團，3’端標記淬滅基團。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于：

所述試劑盒還包括RT-RPA酶制劑、RT-RPA緩沖液、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制劑、NTPs、醋酸鎂和氯化鎂。

7.權利要求1所述的試劑和/或權利要求3~6中任一項所述的試劑盒在非診斷目的的2019-nCoV檢測中的應用。

8.一種非診斷目的的2019-nCoV檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）樣本提取：取待測樣本，提取基因組；

（2）如M1）或M2）：

M1）：一步檢測：將步驟（1）提取的基因組與權利要求6所述的擴增引物對、crRNA、Cas蛋白、信號報告探針、RT-RPA酶制劑、RT-RPA緩沖液、 T7RNA聚合酶、RNA酶抑制劑、NTPs、醋酸鎂、氯化鎂混合，進行RT-RPA擴增和CRISPR反應檢測，讀取檢測信號，即得；

M2）：兩步檢測：

M21）RT-RPA擴增：將步驟（1）提取的基因組與權利要求6所述的擴增引物對、RT-RPA酶制劑、RT-RPA緩沖液混合，進行RT-RPA擴增，得到擴增產物；

M22）CRISPR檢測：將步驟M21）得到的擴增產物與權利要求6所述的crRNA、Cas蛋白、信號報告探針、NTPs、醋酸鎂、氯化鎂混合，進行CRISPR反應檢測，讀取檢測信號，即得。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：

步驟M1）檢測的條件為36～38℃下反應25～30min；

步驟M21）中RT-RPA擴增的條件為36～38℃下反應25～30min；

步驟M22）中檢測的條件為36～38℃下反應25～30min。