[發明專利]利用間充質干細胞分泌的活性因子制備疤痕凝膠的方法

有效

• 申請號: 202011592099.0
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN112587718B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 孫紅;邢志青;崔晨聰;王杰;張甜甜;張平;鄭海陽
• 申請（專利權）人: 濟南磐升生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61L26/00;C12P21/00
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 房一粟

1.一種利用間充質干細胞分泌的活性因子制備疤痕凝膠的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）取0.7-0.9重量份的卡波940、0.08-0.12重量份的卡波981、0.18-0.22重量份的PHA、0.008-0.012重量份的透明質酸和85-95重量份的去離子水依次加入乳化罐中，加熱至70-100℃，保溫攪拌15-40min至完全溶解，降溫到40-50℃以下，獲得A相溶液；

2）取8-12重量份的丁二醇、1.6-2.0重量份的10% NaOH、0.3-0.7重量份的CHA150，依次加入步驟1）獲得的A相溶液中，持續攪拌降溫至室溫，降溫后加入0.1-0.5重量份的三維培養的臍帶間充質干細胞分泌的活性因子，攪拌均勻獲得疤痕凝膠，分裝4℃保存；

所述的三維培養的臍帶間充質干細胞分泌的活性因子的制備方法包括如下步驟：

S1 選取臍帶分離培養間充質干細胞，獲得原代臍帶間充質干細胞；

S2 將步驟S1中獲得的原代臍帶間充質干細胞擴增培養，細胞融合至80%獲得傳代臍帶間充質干細胞；

S3取無血清培養基置于二氧化碳培養箱中，35-36℃溫育30min，獲得處理后的培養基；

S4 取微載體Cytodex-3使用10-30mL步驟S3獲得的處理后的培養基潤洗，按1-10g/L的密度接種至攪拌式生物反應器中，加入1/3-1/2的工作體積的處理后的培養基，然后加入步驟S2中獲得傳代臍帶間充質干細胞，細胞接種密度為10⁵-10⁶cells/mL，攪拌式生物反應器以30-50r/min攪拌6-24h，控制參數設為溫度35-37℃，pH為6.8-7.4，溶解氧為30%-80%，補充培養基至前述工作體積后調節攪拌速度為40-70r/min；培養前期每3天更換50%培養基，6天后灌注培養，每天灌注，灌注體積為工作體積的0.5-2倍，提高攪拌速度到60-100 r/min，溫度35-37℃，pH為6.9-7.2，溶解氧為50-80%，收集細胞培養液；所述工作體積為生物反應器體積的55-70%；

S5 將步驟S4獲得的細胞培養液2900-3000rpm離心8-10min，保留上清液，上清液使用0.22μm的無菌濾器過濾除菌后采用超濾濃縮法濃縮，超濾膜的截留分子量3000KD，獲得臍帶間充質干細胞分泌的活性因子，分裝后置于-20℃長期冷凍保存。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S1中所述的分離培養間充質干細胞包括如下步驟：

SS1 選取新生兒臍帶組織清洗后剝離臍帶中的血管、表皮，獲得華通膠；

SS2 將獲得的華通膠切塊后均勻鋪在不加培養基的空白培養皿中，置于二氧化碳培養箱中，37℃、5% CO₂，8-12h內加入完全培養基浸沒組織塊，5天半后換液，此后每2-3天換一次液，細胞融合達到80%-90%，獲得原代臍帶間充質干細胞。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2所述的原代臍帶間充質干細胞擴增培養，包括如下步驟：

將步驟S1中獲得的原代臍帶間充質干細胞用5ml生理鹽水清洗2次，加入1ml胰酶-EDTA消化1-2min，加入7-10mL完全培養基終止消化，收集細胞，1000rpm離心5min，再用新鮮無血清培養基重懸細胞，計數，按1.5×10⁷個細胞/mL接種至T150培養瓶，加入新鮮無血清培養基，在37℃、5%CO₂條件下培養，細胞融合至80%，獲得傳代臍帶間充質干細胞。

4.如權利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的完全培養基的配方為：450mL α-MEM培養基、50mL胎牛血清FBS、25μg人表皮生長因子、10μg血管內皮生長因子。

5.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述的無血清培養基為475mL α-MEM培養基和25mL Elite Gro TM-Adv混合。

6.如權利要求1-3中任一項所述的方法獲得的疤痕凝膠。

7.權利要求6所述疤痕凝膠在促進細胞的增殖、遷移和分化中的應用。