[發明專利]三篩選標記的抗體表達載體以及應用

在審

• 申請號: 202011590075.1
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN112626121A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 胡迪超;隋禮麗;孔令潔
• 申請（專利權）人: 蘇州博騰生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/52;C12N15/53;C12N15/13;C12N5/10
• 代理公司: 蘇州新知行知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32414
• 代理人: 馬素琴

本發明公開了一種三篩選標記的抗體表達載體，在同一載體中包括表達框一和表達框二，表達框二以順向排列的方式緊鄰表達框一，在表達框一中，嘌呤霉素抗性基因PuroR通過IRES序列偶聯在抗體的輕鏈基因的下游，再通過E2A多肽將鼠谷氨酰胺合成酶mGS偶聯在嘌呤霉素抗性基因PuroR的下游；在表達框二中，二氫葉酸還原酶基因DHFR通過IRES序列偶聯在抗體的重鏈基因的下游。本發明的三篩選標記的抗體表達載體，在抗體的輕鏈上鏈接了PuroR基因和mGS基因，在抗體的重鏈上鏈接了DHFR基因，在篩選時，通過控制MTX和MSX的濃度，控制輕鏈和重鏈的表達平衡，既能使目標抗體的質量提高，避免產生片段化抗體或多聚體抗體，又能使目標抗體的產量提高。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是一種三篩選標記的抗體表達載體以及構建方法和應用。

背景技術

抗體藥物是當今生物醫藥發展的主流，要實現抗體藥物的大規模生產，第一步必須要構建高效表達目標抗體的穩定細胞株。其中，抗體表達載體是構建高效表達目標抗體穩定細胞株的關鍵物質。

二氫葉酸還原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（GS）是細胞生長代謝通路中的關鍵物質，分別為細胞的增殖提供碳源和氮源。當細胞基因組中的二氫葉酸還原酶（DHFR）缺失或失活（也可能采用基因敲除的方法使其失活），并且培養基中缺乏碳源的補救合成途徑（如次黃嘌呤H和胸腺嘧啶T）時，細胞將由于缺乏碳源而死亡。與其類似，當細胞基因組中谷氨酰胺合成酶基因缺失（也可能采用基因敲除的方法使其失活）或者谷氨酰胺合成酶表達水平較低，并且培養基中缺乏氮源供應時（如谷氨酰胺），細胞將由于缺乏氮源而死亡。因此，當前基于二氫葉酸還原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（GS）基因的抗體表達載體是實現抗體高效表達的主要策略。對于二氫葉酸還原酶（DHFR）基因缺失或失活的細胞，在細胞培養過程中加入DHFR的抑制物-甲氨蝶呤（MTX），細胞將死亡，而只有從外源（如載體或質粒）整合了二氫葉酸還原酶（DHFR）基因的細胞才能存活并實現增殖。同樣，對于谷氨酰胺合成酶基因缺失（也可能采用基因敲除的方法使其失活）或者谷氨酰胺合成酶表達水平較低的細胞，在細胞培養過程中加入GS抑制物-蛋氨酸亞氨基代砜（MSX）時細胞將死亡，而只有從外源整合（如載體或質粒）了谷氨酰胺合成酶（GS）基因的細胞才能存活并實現增殖。

但是，當二氫葉酸還原酶（DHFR）基因或谷氨酰胺合成酶（GS）缺失或失活的細胞從外源載體或質粒獲得了DHFR基因或GS基因后，當培養基中再加入MTX或MSX后，細胞由于抑制壓力選擇而使整合進細胞基因組的外源DHFR或GS擴增100~1000倍以上以表達足夠量的二氫葉酸還原酶或谷氨酰胺合成酶以維持生存。與此同時，當整合進細胞基因組的二氫葉酸還原酶（DHFR）基因或谷氨酰胺合成酶（GS）擴增時，可連帶其基因組兩側的數kb~10kb（堿基對）長的基因一起進行擴增，形成共擴增效應。因此，基于此特性，當前用于構建抗體高效表達穩定細胞株的抗體篩選系統為DHFR/MTX擴增系統和GS/MSX擴增系統。

傳統的DHFR/MTX擴增系統如Thermo公司推出的中國倉鼠卵巢細胞DG44（二氫葉酸還原酶缺陷型）（CHO-DG44），配套的外源表達載體為pcDNA3.3-TOPO（含新霉素抗性基因）和pOptiVEC-TOPO（含二氫葉酸還原酶表達框）。中國倉鼠卵巢細胞S（二氫葉酸還原酶低表達型）（CHO-S）抗體表達系統，配套的外源表達載體為pCHO 1.0（含二氫葉酸還原酶表達框和嘌呤霉素抗性基因表達框）。兩種DHFR/MTX擴增系統都可以分別表達抗體輕鏈和重鏈。

傳統的GS/MSX開發和商業化的公司包括Lonza和Merk，Lonza公司分別推出一代抗體表達系統GS-CHOK1SV（谷氨酰胺合成酶低表達的CHO細胞）和二代抗體表達系統CHOK1SVGS-KO（谷氨酰胺合成酶基因缺失的CHO細胞）。Merk公司于2012年推出了CHOZN GSAntibody Expression System（谷氨酰胺合成酶基因缺失的CHO細胞），其配套的表達載體均含有谷氨酰胺合成酶基因。