[發明專利]一種重組慢病毒載體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202011584923.8
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN112626127B
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發明（設計）人: 蔣明貴;劉軍鵬;方娟;劉彩云;屈飛
• 申請（專利權）人: 湖南豐暉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/65;C12N15/54;C12N5/10;C12Q1/6897;C12Q1/02
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 肖云

1.一種重組慢病毒載體在細胞內鈣離子濃度的檢測中的應用，其特征在于：所述重組慢病毒載體包括插入有綠色熒光基因EGFP及鈣調素依賴性蛋白激酶II基因的慢病毒載體，所述慢病毒載體選用Tet-On誘導表達慢病毒系統；慢病毒出發載體序列如SEQ ID NO.17所示，所述EGFP基因插入到慢病毒出發慢病毒載體的TRE3啟動子下游的MCS區，由TRE3啟動子控制表達，并由dox來調控其表達；所述鈣調素依賴性蛋白激酶II基因替換掉慢病毒出發載體上SV40啟動子后的puro元件。

2.一種重組慢病毒，其特征在于：所述重組慢病毒采用如權利要求1中所述的重組慢病毒載體與包裝質粒共轉染哺乳細胞制備得到。

3.根據權利要求2所述的重組慢病毒，其特征在于：所述哺乳細胞包括293T細胞或293F細胞。

4.一種重組細胞，其特征在于：所述重組細胞包括含有權利要求1中所述的重組慢病毒載體和/或權利要求2或3所述的重組慢病毒的宿主細胞。

5.一種如權利要求1中所述的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟：將EGFP基因和CAMKII基因分別克隆至慢病毒載體中得到所述重組慢病毒載體。

6.一種檢測細胞內鈣離子濃度變化的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：將權利要求1中所述的重組慢病毒載體感染待測目的細胞，根據EGFP的表達判斷質粒的轉染效率，此時鈣調素依賴性蛋白激酶II基因的表達不受影響，然后去除Tet誘導使EGFP表達受到抑制，隨后采用鈣離子熒光探針對細胞內鈣離子進行檢測，根據所述目的細胞的熒光強度變化測定鈣離子濃度的變化。