[發明專利]乙型血友病患者來源的誘導多能干細胞的基因矯正及肝系分化方法及其應用

在審

• 申請號: 202011579293.5
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN112608943A
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 蔣永平;何瓊;王含璐;馬鈺波;程濤
• 申請（專利權）人: 蘇州方舟生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/57;C12N15/10;C12N5/10;C12N5/071;A61K35/407;A61P7/04
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 肖明芳

本發明公開一種乙型血友病患者來源的誘導多能干細胞的基因矯正及肝系分化方法，針對乙型血友病病人的基因突變位點，利用CRISPR/Cas9系統進行定點基因矯正，篩選成功獲得矯正的iPS細胞定向擴增分化為肝細胞，該細胞可在體內外表達正常的具有功能的F IX因子，實現乙型血友病的個性化基因和細胞治療，可以大大節省治療成本，同時避免了中和性抗體，病毒感染和血友性關節炎等相關疾病的產生。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種乙型血友病患者來源的誘導多能干細胞的基因矯正及肝系分化方法及其應用。

背景技術

乙型血友病是凝血因子IX缺乏引起的一種遺傳性出血性疾病，約占全部血友病病人的15％左右。乙型血友病發病機制主要是由于F IX基因發生點突變、框架移位、缺失、插入等，導致F IX蛋白質結構或功能異常，從而出現凝血障礙。人F IX基因位于X染色體，全長3.4kb，由8個外顯子和7個內含子以及側翼序列組成。成熟的人類F IX由415個氨基酸殘基組成，分子量為57000，其中約20％為糖類。在肝細胞內合成，由一個γ-羧基谷氨酸區(Gla)，兩個類似表皮生長因子(EGF)區，一個激活肽(AP)區和一個催化區構成。在F IX修飾分泌過程中，會釋放28個氨基酸的信號肽和18個氨基酸的前肽。當被激活的時候，F IX會在精氨酸145-丙氨酸146肽鍵和精氨酸180-纈氨酸181肽鍵2個位點先后發生裂解，釋放35個氨基酸激活肽，從而形成重鏈-輕鏈結構的功能F IX。

目前乙型血友病的治療方法主要是外源凝血因子替代法，即采用新鮮冰凍血漿、血漿冷沉淀物、重組凝血因子等補充缺失的F IX。但是這種方法不僅成本高，而且可能引起中和性抗體，病毒感染和血友性關節炎等相關疾病，一定程度上又加重了患者的疾病負擔。

發明內容

發明目的：為解決現有技術中存在的技術問題，本發明提出一種制備乙型血友病患者自體誘導多能干細胞的方法，利用乙型血友病病人來源的iPS細胞(誘導性多能干細胞)，針對病人的基因突變位點，利用CRISPR/Cas9系統進行定點基因矯正，篩選成功獲得矯正的iPS細胞定向擴增分化為肝細胞，該細胞可在體內外表達正常的具有功能的F IX因子，實現乙型血友病的個性化基因和細胞治療。

為實現上述目的，本發明提出了一種制備乙型血友病患者自體誘導多能干細胞的方法，針對乙型血友病病人的基因突變位點，利用CRISPR/Cas9系統進行定點基因矯正，篩選成功獲得矯正的iPS細胞定向擴增分化為肝細胞。

其中，通過如下方法檢測患者的基因突變位點：對乙型血友病患者來源的iPS細胞，提取該iPS細胞基因組DNA，利用如下引物序列對外顯子序列進行PCR擴增并測序：

引物1：正向引物：CCACTGCCCATTCTCTTCA；

反向引物：TACTTACCAACCTGCGTGCT；

引物2：正向引物：CATGCCCTAAAGAGAAATTGG；

反向引物：TGGGTTAGAGGGTTGGACTG；

引物3：正向引物：TCAGGAAGACAGGAGCATCA

反向引物:GAGGGAAACTTTGAACCATGAG；

引物4：正向引物：ACCCATACATGAGTCAGTAGTTCC；

反向引物：GACACAGAAAGAATTCAGGTTGTAG；

引物5：正向引物：AATACTGATGGGCCTGCTTC；

反向引物：ACCTGGCCTGTGTCTTGC；

引物6：正向引物：GCCTATTCCTGTAACCAGCAC；

反向引物：GACCCTTCTGCCTTTAGCC；