[發(fā)明專利]一種基于ddPCR檢測CRISPR/Cas誘導(dǎo)的基因突變和基因編輯頻率的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011575802.7
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN112646866A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭城;徐俊鋒;丁霖;陳笑蕓;汪小福
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 王煥

1.一種基于ddPCR檢測CRISPR/Cas誘導(dǎo)的基因突變的方法，其特征在于，所述方法包括：

根據(jù)CRISPR/Cas靶序列的突變位置，設(shè)計一對變異位點特異性PCR擴(kuò)增引物和變異位點特異性探針，以及一對內(nèi)源參考基因特異性PCR擴(kuò)增引物和內(nèi)源參考基因特異性探針；

其中，所述變異位點特異性探針設(shè)置在突變位點區(qū)域，并且探針的5’端位于PAM區(qū)且連接有第一熒光基團(tuán)，3’端連接有第一淬滅基團(tuán)；所述內(nèi)源參考基因特異性探針的5’端連接有第二熒光基團(tuán)，3’端連接有第二淬滅基團(tuán)，所述第一熒光基團(tuán)和所述第二熒光基團(tuán)不同。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：

采用權(quán)利要求1的引物和探針進(jìn)行ddPCR反應(yīng)；

依據(jù)熒光微滴的熒光信號得出結(jié)果：第一熒光和第二熒光兩種熒光信號均為陽性的微滴為野生型微滴，第二熒光信號陽性但第一熒光信號陰性的微滴為突變型微滴。

3.一種基于ddPCR檢測CRISPR/Cas誘導(dǎo)的基因編輯頻率的方法，其特征在于，所述方法在根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法獲得熒光微滴的熒光信號結(jié)果的基礎(chǔ)上，計算突變型微滴拷貝數(shù)與野生型微滴拷貝數(shù)的比值來計算基因編輯突變頻率。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一淬滅基團(tuán)選自BHQ或MGB；所述第一熒光基團(tuán)和所述第二熒光基團(tuán)選自FAM、HEX和TEX中的任一種；優(yōu)選地，所述第一熒光基團(tuán)為FAM，所述第二熒光基團(tuán)為HEX。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas靶序列為水稻TGW6基因的一段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述變異位點特異性PCR擴(kuò)增引物的上下游引物序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述變異位點特異性探針的序列如SEQ ID NO.3所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)源參考基因特異性PCR擴(kuò)增引物的上下游引物序列分別如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述內(nèi)源參考基因特異性探針的序列如SEQ ID NO.6所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括提取植物模板DNA，然后將所述模板DNA與變異位點特異性PCR擴(kuò)增引物和變異位點特異性探針以及內(nèi)源參考基因特異性PCR擴(kuò)增引物和內(nèi)源參考基因特異性探針一起制備反應(yīng)混合物，使用所述反應(yīng)混合物進(jìn)行ddPCR反應(yīng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述ddPCR反應(yīng)中，引物的濃度為400-600nM，優(yōu)選地，引物的濃度為450-500nM；探針的濃度為200-400nM；優(yōu)選地，探針的濃度為250-300nM。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述ddPCR反應(yīng)的程序為93℃-96℃5-15min，93℃-95℃5-15s，55℃-60℃退火和延伸50-70s，35-40個循環(huán)，95-100℃下8-12min終止反應(yīng)。