[發明專利]高產甲殼素脫乙酰酶的菌劑組合及其應用

有效

• 申請號: 202011574278.1
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112553123B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 蔡俊;郭依依;王常高;杜馨;趙澤鑫
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/80;C12P19/26;C12R1/01;C12R1/085
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 江麗麗

本發明公開了一種高產甲殼素脫乙酰酶的菌劑組合，包括紅球菌HQcdag（Rhodococcus sp.)，保藏編號CCTCC NO:M 2020336，以及蠟狀芽孢桿菌CJPE209（Bacillus cereus），保藏編號CCTCC NO:M 2015734。相比紅球菌單獨發酵，這兩株菌通過協同發酵將甲殼素脫乙酰酶的酶活提升了約14倍，且顯著縮短了發酵時間。

技術領域

本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種高產甲殼素脫乙酰酶的菌劑組合及其應用。

背景技術

甲殼素(C8H13O5N)n，又稱幾丁質，是存在于各類甲殼動物的外殼及真菌細胞壁中的一種難溶的N-乙酰-D-葡萄糖胺聚合物。甲殼素脫乙酰率達到55％及以上即為殼聚糖，殼聚糖廣泛應用于工業(布料、衣物、染料、紙張和水處理等)，農業(殺蟲劑、植物抗病毒劑)，漁業(養魚飼料、化妝品美容劑、毛發保護、保濕劑等)，醫療產業(隱形眼鏡、人工皮膚、縫合線、人工透析膜和人工血管等)等領域，尤其在生物醫學領域，由于其良好的生物相容性，在組織工程、創傷愈合、生物傳感器方面有很好的應用前景。

殼聚糖的制備方法主要有化學法、物理法、發酵法和酶法等。應用最廣泛的是化學法，在高溫條件下，用強堿溶液浸泡甲殼素脫去乙?；鶃碇苽錃ぞ厶恰；瘜W法制備殼聚糖耗堿量大、污染環境、得到的產品特性不穩定(乙酰度不均勻，分子量變化大，乙酰基所在位置不固定)；發酵法即利用發酵工廠的廢菌絲體來提取殼聚糖，此方法可綜合利用工業廢渣，但是所得產物雜質較多，分離純化步驟較為復雜；物理法主要有微波法和超聲波法，耗能高、脫乙酰效果差。酶法制備殼聚糖有望解決上述方法所存在的問題，具有良好的應用前景。

在甲殼素酶法脫乙酰制備殼聚糖的過程中，常用的酶有甲殼素酶、殼聚糖酶、甲殼素脫乙酰酶、幾丁二糖酶等。從作用機制來看，甲殼素酶、殼聚糖酶和幾丁二糖酶都具有切斷糖鏈分子的作用，只有甲殼素脫乙酰酶是專一性的用于甲殼素脫去乙?；拿福诿撘阴５倪^程中，不會切斷殼聚糖分子的的糖鏈。同屬甲殼素酶系的其他酶對于甲殼素脫乙酰酶的協同作用尚未報道，但存在可能。

甲殼素脫乙酰酶(chitin deacetylase,E.C.3.5.41，以下簡稱CDA)可作用于甲殼素及甲殼素的相關衍生物，如甲殼寡糖、羧甲基甲殼素、甲殼素的脂肪族二元醇等，此外甲殼素脫乙酰酶還可作用于不同狀態的甲殼素，如膠狀甲殼素、粉狀甲殼素、無定型甲殼素和晶態甲殼素等。研究發現，甲殼素脫乙酰酶的水解過程大致如下：首先，甲殼素脫乙酰酶隨機結合到底物分子鏈的任一序列上，然后以結合部位的非還原端為起點，沿著該鏈脫去乙?；?，水解完畢后，與底物解離，然后結合到另一條底物分子鏈上，開始新一輪的水解。研究發現，作用的底物(分子鏈長度)對CDA脫乙酰的效果影響很大。Martinou等研究來源于Mucor rouxii的甲殼素脫乙酰酶作用于全水溶性部分N乙酰化殼聚糖時發現，底物為水溶性殼多聚糖(30單位聚體)時，底物的脫乙酰作用位點在三個或三個以上時才能被該酶水解。當作用底物為甲殼寡糖(2～7單位聚體)時，甲殼素脫乙酰酶只對三個及以上的甲殼寡糖底物具有活性。

產甲殼素脫乙酰酶菌株大多為真菌，已在毛霉、根霉、被孢霉、犁頭霉、酵母等十幾個真菌中檢測到，最早由Araki和Ito于1974年在魯氏毛霉中發現；已知產該酶的細菌不多，有短桿菌、紅平紅球菌、炭疽菌、枯草芽孢桿菌等。如Kauss等發現的Colletotrichumlindemuthianum菌株可將甲殼素脫乙酰酶分泌到細胞外，從培養液中直接提取，純蛋白的比活最高達72U/ml；放線菌作為產甲殼素脫乙酰酶菌株，其自身產的抗生素可減少染菌機率，但也可能抑制酶活。王瑤等篩選出的放線菌桔橙小單孢菌可產慶大霉素、羅沙米星等多種抗菌抗生素，具有良好的脫乙酰效果。