[發明專利]無血清培養基在分離和傳代脂肪間充質干細胞中的用途

有效

• 申請號: 202011568942.1
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112522193B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 王正;劉冰;肖海蓉;湯樂
• 申請（專利權）人: 博雅干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.分離和傳代培養脂肪間充質干細胞的方法，其包括(a)分離培養原代脂肪間充質干細胞和(b)傳代培養脂肪間充質干細胞兩個階段，其中：

(a)分離培養原代脂肪間充質干細胞的階段包括如下步驟：

(a1)在生物安全柜中處理經2-8℃冷鏈運輸至實驗室的脂肪樣本；

(a2)使脂肪樣本離心，移取上層脂肪組織，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次離心，移取脂肪組織，加入1% Ⅱ型膠原酶振蕩消化；

(a3)消化結束后，加一倍體積D-hanks液稀釋，離心，留取底層的細胞沉淀進行接下來的操作；

(a4)取步驟(3)所得細胞沉淀，加入原代增補培養基重懸，取樣計數，按照規定細胞量接種至培養瓶；置CO₂培養箱中培養；

(a5)培養3d后培養基全換液一次，至細胞融合度達80%以上后，去舊培養基，用D-hanks液清洗細胞，加入重組胰酶溶液消化細胞，使細胞脫落，加入D-hanks液稀釋，離心，將細胞沉淀用原代增補培養基重懸，即得原代脂肪間充質干細胞，即P0代；

(b)傳代培養脂肪間充質干細胞的階段包括如下步驟：

(b1)按照5000/cm²密度接種原代即P0代間充質干細胞于T225瓶中，補充傳代完全培養基至45ml，置CO₂培養箱中，于5% CO₂、37℃、飽和濕度條件，培養至細胞融合度達70~80%時，棄舊培養基，用D-hanks液清洗細胞后，每瓶加5ml重組胰酶溶液消化細胞2min使細胞脫落，每瓶加D-hanks液15ml稀釋，合并所有細胞懸液至50ml離心管內，離心，用傳代完全培養基使細胞沉淀重懸，得到P1代間充質干細胞；

(b2)按照5000/cm²密度將P1代間充質干細胞接種于T225瓶中，補充傳代完全培養基至45ml，置CO₂培養箱中，于5% CO₂、37℃、飽和濕度條件，參照P1傳代培養方法，得到P2代間充質干細胞；接著照以上P1代和P2代的方法將細胞持續傳代至P10代，得到各代次的間充質干細胞，

其中，

所述D-Hanks液的配方組成為：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH₂PO₄、0.08g的Na₂HPO₄.12H₂O、0.35g的NaHCO₃、水至1000ml；

所述原代增補培養基是以DMEM-F12培養基為基質配制并且添加：1%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重組胰島素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12%硫代甘油、1%果糖；

所述傳代完全培養基是以DMEM-F12培養基為基質配制并且添加：2.5%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重組胰島素、10ng/ml的EGF、15ng/ml的bFGF、0.04%硫代甘油、1%果糖。

2.根據權利要求1的方法，步驟(a2)中，兩次離心均以100xg離心5min的條件進行操作。

3.根據權利要求1的方法，步驟(a2)中，加入2倍體積的1% Ⅱ型膠原酶振蕩消化30min。

4.根據權利要求1的方法，步驟(a3)中，離心是以100xg離心5min的條件進行操作。

5.根據權利要求1的方法，步驟(a4)中，按照規定細胞量接種至培養瓶是指按照細胞量1~5×10⁴/cm²接種至T75瓶。

6.根據權利要求1的方法，步驟(a4)中，按照規定細胞量接種至培養瓶是指按照細胞量2×10⁴/cm²接種至T75瓶。

7.根據權利要求1的方法，步驟(a4)中，CO₂培養箱中培養的條件為：5% CO₂，37℃，飽和濕度。