[發明專利]一種增強vgbS基因轉錄水平的谷氨酰胺轉氨酶高產菌株及其制備與發酵方法

在審

• 申請號: 202011567740.5
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN114686389A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 步國建;武立清;白林泉
• 申請（專利權）人: 江蘇東匯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/21;C12N15/76;C12N9/10;C12R1/465
• 代理公司: 上海德禾翰通律師事務所 31319
• 代理人: 夏思秋

1.一種茂原鏈霉菌IPIE，其特征在于，所述菌株的分類名為茂原鏈霉菌Streptomycesmobaraensis IPIE，保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC NO：M2020197，保藏日期為2020年6月10日。

2.一種谷氨酰胺轉氨酶高產菌株TGS105，其特征在于，所述菌株通過增強vgbS基因的轉錄水平而獲得的。

3.如權利要求2所述的谷氨酰胺轉氨酶高產菌株TGS105，其特征在于，所述菌株通過在如權利要求1所述的茂原鏈霉菌IPIE中利用TGase的啟動子TGasep*過量表達來源于透明顫菌中優化后的vgbS基因后獲得。

4.如權利要求2或3所述的谷氨酰胺轉氨酶高產菌株TGS105，其特征在于，所述菌株的vgbS基因過量表達；和/或，所述vgbS編碼基因的序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述菌株含有啟動子TGasep*過量表達來源于透明顫菌中優化后的vgbS基因的表達盒。

5.如權利要求4所述的谷氨酰胺轉氨酶高產菌株TGS105，其特征在于，所述表達盒含有啟動子TGasep*、vgbS基因、轉錄終止序列。

6.一種增強vgbS基因的轉錄水平以提高谷氨酰胺轉氨酶發酵水平的方法，其特征在于，通過在如權利要求1所述的茂原鏈霉菌IPIE中過量表達來源于透明顫菌中優化后的vgbS基因，提高微生物發酵過程中的溶氧水平，促進谷氨酰胺轉氨酶酶原的分泌，進而提升谷氨酰胺轉氨酶產量；

具體步驟如下：

第一步：設計并構建用于過量表達vgbS基因的整合型質粒載體pTDS105；

第二步：利用整合型質粒載體pTDS105，在受體菌茂原鏈霉菌IPIE染色體上插入一個拷貝的來源于透明顫菌優化后的vgbS基因，并通過抗性和PCR驗證篩選得到基因過量表達的重組突變株TGS105；

第三步：將活化后的vgbS基因過量表達突變株TGS105孢子接種于種子培養基中，25-35℃、180-220rpm的條件下培養20-24h，以8-15％的接種量轉接至發酵培養基中，分別于25-35℃、180rpm和25-35℃、150rpm的條件下發酵28-32h，收集發酵液并進行酶活檢測。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述整合型質粒載體pTDS105的構建方法為：通過PCR擴增得到1008bp的TGpr和441bp的vgbS基因序列的PCR片段，通過酶切連接的方法連入整合型質粒pDR3-Kp*的BamHI/EcoRI 位點，得到所述整合型質粒載體pTDS105。

8.如權利要求6所述的提高谷氨酰胺轉氨酶發酵水平的方法，其特征在于，

所述種子培養基包括：甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，魚粉蛋白胨2-3w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.5w/v％，pH 7.4；

所述發酵培養基包括：甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，魚粉蛋白胨2-3w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.5w/v％，發酵促進劑0.1-0.3w/v％，pH7.4。

9.一種谷氨酰胺轉氨酶高產菌株的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：

第一步：設計并構建用于過量表達vgbS基因的整合型質粒載體pTDS105；

第二步：利用整合型質粒載體pTDS105，在受體菌茂原鏈霉菌IPIE染色體上插入一個拷貝的來源于透明顫菌優化后的vgbS基因，并通過抗性和PCR驗證篩選得到基因過量表達的重組突變株TGS105。