[發明專利]一種檢測SARS-CoV-2病毒的引物探針組合及其應用

在審

• 申請號: 202011567025.1
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112831600A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 王雷雷;王志偉;楊舒婷;施慶喜
• 申請（專利權）人: 連云港市婦幼保健院（連云港市第三人民醫院）
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種檢測SARS-CoV-2病毒的引物探針組合，其特征在于，所述檢測SARS-CoV-2病毒的引物探針組合特異性擴增并檢測SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因、N基因或E基因中的任意一種或至少兩種的組合；

擴增所述ORF1ab基因的特異性引物對包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，檢測所述ORF1ab基因的探針包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

擴增所述N基因的特異性引物對包括SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列，檢測所述N基因的探針包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；

擴增所述E基因的特異性引物對包括SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列，檢測所述E基因的探針包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的檢測SARS-CoV-2病毒的引物探針組合，其特征在于，所述檢測SARS-CoV-2病毒的引物探針組合中包括特異性擴增并檢測SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因、N基因和E基因的特異性引物對和探針；

優選地，所述檢測SARS-CoV-2病毒的引物探針組合包括SEQ ID No.1～9所述的核苷酸序列。

3.根據權利要求1或2所述的檢測SARS-CoV-2病毒的引物探針組合，其特征在于，所述探針包括雙標記探針、分子信標探針或能量傳遞熒光探針中的任意一種或至少兩種的組合，優選為雙標記探針；

優選地，所述探針包括熒光標記基團和熒光淬滅基團；

優選地，所述熒光標記基團包括FAM、Alexa Fluor 488、ATTO488、TET、JOE、VIC、AlexaFluor 532、ATTO532、HEX、ROX、Alexa Fluor 594、ATTO594、TAMRA、CY3、CY3.5、CY5、AlexaFluor 647、ATTO647、CY5.5、OregonGreenTM、CALRedTM、Red640、TexasRed、Alexa Fluor700或ATTO700中的任意一種或至少兩種的組合；

優選地，檢測所述ORF1ab基因的探針包括熒光標記基團FAM和熒光淬滅基團BHQ1；

優選地，檢測所述N基因的探針包括熒光標記基團HEX和熒光淬滅基團BHQ1；

優選地，檢測所述E基因的探針包括熒光標記基團ROX和熒光淬滅基團BHQ2。

4.一種基于微流控數字PCR的SARS-CoV-2病毒聯合檢測試劑盒，其特征在于，所述基于微流控數字PCR的SARS-CoV-2病毒聯合檢測試劑盒包括如權利要求1～3任一項所述的檢測SARS-CoV-2病毒的引物探針組合。

5.根據權利要求4所述的基于微流控數字PCR的SARS-CoV-2病毒聯合檢測試劑盒，其特征在于，所述基于微流控數字PCR的SARS-CoV-2病毒聯合檢測試劑盒還包括RT-dPCR反應液、RT-dPCR反應酶、陰性質控品、陽性質控品、密封油和數字PCR芯片；

優選地，所述RT-dPCR反應液包含三羥甲基氨基甲烷、鎂離子、鉀離子和dNTPs；

優選地，所述RT-dPCR反應酶包含反轉錄酶、DNA聚合酶和RNA酶抑制劑；

優選地，所述RT-dPCR反應酶還包含UNG酶；

優選地，所述陰性質控品包括生理鹽水；

優選地，所述陽性質控品包括人工合成的含有SARS-CoV-2病毒目標片段基因的重組質粒和/或RNA假病毒。

6.根據權利要求4或5所述的基于微流控數字PCR的SARS-CoV-2病毒聯合檢測試劑盒，其特征在于，所述基于微流控數字PCR的SARS-CoV-2病毒聯合檢測試劑盒還包括內源性管家基因GAPDH的特異性引物對SEQ ID No.10～11及其探針SEQ ID No.12。

7.根據權利要求6所述的基于微流控數字PCR的SARS-CoV-2病毒聯合檢測試劑盒，其特征在于，所述GAPDH基因的探針包括熒光標記基團Cy5和熒光淬滅基團BHQ3。