[發(fā)明專利]增強(qiáng)VOC family protein基因的表達(dá)提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量的方法

在審

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• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN114686408A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 步國建;武立清;白林泉
• 申請（專利權(quán)）人: 泰興市東圣生物科技有限公司;江蘇東匯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/10;C12N15/76;C12N15/31;C12R1/465
• 代理公司: 上海德禾翰通律師事務(wù)所 31319
• 代理人: 夏思秋

1.一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株TGS102，其特征在于，所述菌株通過增強(qiáng)VOC familyprotein基因SMDS_2194的轉(zhuǎn)錄水平而獲得的。

2.如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株TGS102，其特征在于，所述菌株通過在茂原鏈霉菌C2利用人工強(qiáng)啟動子kasOp*過量表達(dá)來源于茂原鏈霉菌C2的VOC familyprotein基因SMDS_2194后獲得；

所用茂原鏈霉菌C2的分類名為茂原鏈霉菌Streptomyces mobaraensisC2，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC NO：M2020194，保藏日期為2020年6月10日。

3.如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株TGS102，其特征在于，所述菌株的VOCfamily protein基因SMDS_2194過量表達(dá)；和/或，所述VOC family protein基因SMDS_2194的序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如權(quán)利要求1所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株TGS102，其特征在于，所述菌株含有人工強(qiáng)啟動子kasOp*過量表達(dá)來源于茂原鏈霉菌C2的VOC family protein基因SMDS_2194的表達(dá)盒。

5.如權(quán)利要求4所述的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株TGS102，其特征在于，所述表達(dá)盒含有人工強(qiáng)啟動子kasOp*、VOC family protein基因SMDS_2194、轉(zhuǎn)錄終止序列。

6.一種增強(qiáng)VOC family protein基因SMDS_2194的轉(zhuǎn)錄水平以提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶發(fā)酵水平的方法，其特征在于，步驟如下：

第一步：設(shè)計并構(gòu)建用于過量表達(dá)VOC family protein基因SMDS_2194的整合型質(zhì)粒載體pTDS102；

第二步：利用整合型質(zhì)粒載體pTDS102，在受體菌茂原鏈霉菌C2染色體上插入一個拷貝的來源于如權(quán)利要求2中所述的茂原鏈霉菌C2的VOC family protein基因SMDS_2194，并通過抗性和PCR驗(yàn)證篩選得到基因過量表達(dá)的重組突變株TGS102；

將培養(yǎng)的VOC family protein基因SMDS_2194過量表達(dá)突變株TGS102的孢子接種于種子培養(yǎng)基中，25-35℃、180-220rpm的條件下培養(yǎng)20-24h，以8-15％的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，25-35℃、180-220rpm的條件下發(fā)酵28-32h，收集發(fā)酵液并進(jìn)行酶活檢測。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)粒載體pTDS102的構(gòu)建方法為：通過PCR擴(kuò)增得到777bp的VOC family protein基因SMDS_2194序列的PCR片段，通過酶切連接的方法連入整合型質(zhì)粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位點(diǎn)，得到所述質(zhì)粒載體pTDS102。

8.如權(quán)利要求6所述的提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶發(fā)酵水平的方法，其特征在于，

所述種子培養(yǎng)基包括：甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，魚粉蛋白胨2-3w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.5w/v％，pH 7.4；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：甘油1-3w/v％，酵母提取物0.5-1w/v％，魚粉蛋白胨2-3w/v％，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5w/v％，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.5w/v％，發(fā)酵促進(jìn)劑0.1-0.3w/v％，pH7.4。