[發明專利]一種敲除負調控蛋白基因以提高阿卡波糖發酵水平的方法

有效

• 申請號: 202011564851.0
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112522174B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 白林泉;汪雪梅
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/74;C12P19/26;C12R1/045
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

本發明公開了一種敲除負調控基因以提高阿卡波糖發酵水平的方法。采用本發明方法，通過在游動放線菌中，分別敲除負調控蛋白基因ACPL_5445和ACPL_3989，得到阿卡波糖高產突變菌株。通過本發明敲除負調控蛋白基因，可以促進阿卡波糖生物合成基因的表達，最終明顯提高阿卡波糖產量。與出發菌株相比，本發明所得的高產菌株發酵產量分別提高了13％和8％，實驗室搖瓶發酵水平分別達到3.62g/L和3.47g/L。

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體說是涉及一種敲除負調控基因以提高阿卡波糖發酵水平的方法；通過在游動放線菌中敲除負調控基因ACPL_5445和ACPL_3989，以提高阿卡波糖生物合成基因轉錄水平，從而提高阿卡波糖產量。

背景技術

目前，患糖尿病人數在全球范圍內持續增長。2型糖尿病是最常見的糖尿病，約占糖尿病總數的90％以上。許多的臨床研究證明，餐后血糖的合理控制能夠有效減緩或減少部分心腦血管慢性并發癥的發生，口服降糖藥物并結合飲食結構控制與適量運動是行之有效的干預方法。目前用于治療糖尿病的經典降糖藥主要有促胰島素分泌劑、胰島素增敏劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑等。

阿卡波糖是α-葡萄糖苷酶抑制劑的代表藥物，其主要是通過競爭性抑制，降低小腸內的葡萄糖苷酶、蔗糖酶、淀粉酶等的活性，減緩糖類物質分解形成葡萄糖的過程，從而有效降低餐后血糖。由于阿卡波糖不僅可以降低血糖水平，還具有減小血糖波動、調節體脂代謝和預防心血管疾病等功效，因此，自上市以來便成為治療2型糖尿病的理想藥物。在2017年版本的《中國2型糖尿病防治指南》中，阿卡波糖被列入治療2型糖尿病的一線用藥。

阿卡波糖主要由放線菌產生，游動放線菌SE50及其基因工程改造后的高產菌株SE50/110都是非常重要的阿卡波糖產生菌。負責阿卡波糖生物合成的相關基因在游動放線菌SE50的基因組上成簇分布，組成acb基因簇。迄今為止，涉及阿卡波糖生物合成途徑中相關轉錄調控因子及其調控機制的研究仍舊很少。在本發明的研究中，挖掘到與acb基因簇轉錄調控相關的基因ACPL_5445和ACPL_3989，敲除這兩個調控蛋白基因，可以提高阿卡波糖生物合成基因的轉錄水平，從而提高阿卡波糖的產量。

發明內容

本發明的目的在于提供一種通過敲除負調控基因來提高阿卡波糖發酵水平的方法。通過在游動放線菌中敲除負調控基因ACPL_5445和ACPL_3989，以提高阿卡波糖生物合成基因轉錄水平，從而提高阿卡波糖產量。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

本發明涉及一種提高阿卡波糖發酵水平的方法，在游動放線菌中敲除負調控蛋白基因，增強阿卡波糖生物合成基因轉錄水平，從而提高阿卡波糖的發酵產量。是在游動放線菌中敲除負調控蛋白基因，增強阿卡波糖生物合成基因轉錄水平，獲得阿卡波糖高產突變株。對所述突變株進行發酵培養，獲得阿卡波糖。

作為本發明的一個實施方案，所述負調控蛋白基因為負調控蛋白基因ACPL_5445，其序列如SEQ ID NO.1所示。

作為本發明的一個實施方案，所述負調控蛋白基因為負調控蛋白基因ACPL_3989，其序列如SEQ ID NO.2所示。

作為本發明的一個實施方案，在游動放線菌中敲除負調控蛋白基因具體包括如下步驟：

S1，設計并構建用于敲除負調控蛋白基因ACPL_5445的同源重組質粒I；

S2，設計并構建用于敲除負調控蛋白基因ACPL_3989的同源重組質粒II；

S3，通過接合轉移將同源重組質粒I、II分別導入受體菌株(QQ-2)中進行同源重組；

S4，進行安普霉素抗性驗證，之后進行雙交換篩選并提取基因組通過PCR產物片段大小的差異，得到基因敲除的突變株。