[發(fā)明專利]基于物鏡耦合型的表面等離子體耦合發(fā)射定向增強(qiáng)型顯微熒光成像與光譜檢測(cè)方法及裝置

有效

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• 申請(qǐng)日: 2020-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN112649368B
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李耀群;潘曉會(huì);徐子謙;陳敏;曹爍暉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/01
• 分類號(hào): G01N21/01;G01N21/64
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;秦彥蘇

本發(fā)明公開了基于物鏡耦合型的表面等離子體耦合發(fā)射(SPCE)定向增強(qiáng)型顯微熒光成像與光譜檢測(cè)方法及裝置，經(jīng)過半波片調(diào)制的偏振性激發(fā)光經(jīng)二向色濾鏡反射后以特定的角度到達(dá)物鏡，激發(fā)金屬表面等離子體與樣品發(fā)生耦合作用，產(chǎn)生的SPCE信號(hào)經(jīng)由物鏡收集和二向色濾鏡過濾后，通過反射鏡切換導(dǎo)入SPCE顯微熒光成像模塊或SPCE顯微熒光光譜模塊，實(shí)現(xiàn)樣品同一微區(qū)的SPCE顯微熒光成像與光譜的采集。本發(fā)明通過結(jié)合顯微鏡系統(tǒng)，將耦合策略SPCE同時(shí)應(yīng)用于高空間分辨熒光成像與光譜，具有定向增強(qiáng)特性以及微區(qū)尺度上的空間選擇功能，可以獲取樣品同一微區(qū)的高質(zhì)量顯微熒光成像與光譜信息，為檢測(cè)復(fù)雜體系中感興趣微區(qū)的低含量組分提供了一種高效、可靠的手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及顯微光學(xué)成像和光譜分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于表面等離子體耦合發(fā)射(surface plasmon coupled emission，SPCE)的定向增強(qiáng)型顯微熒光成像與光譜檢測(cè)方法及裝置。

背景技術(shù)

隨著生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域向細(xì)胞、小分子的不斷發(fā)展，其對(duì)顯微分析也提出了更高的要求。顯微成像與光譜裝置是光學(xué)成像技術(shù)與光譜技術(shù)的融合，不僅能提供目標(biāo)物的空間成像信息，還能提供豐富的光譜信息，為研究或觀測(cè)微小物體提供了一種新的技術(shù)手段。熒光技術(shù)具有成像速度快、重復(fù)性好、觀察直觀等優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)胞、小分子等領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。近年來，有關(guān)常規(guī)熒光成像與光譜的檢測(cè)方法及裝置得到了迅速的發(fā)展。然而，現(xiàn)有的熒光顯微成像與光譜普遍基于非增強(qiáng)型的常規(guī)信號(hào)，對(duì)于復(fù)雜體系中低含量組分的檢測(cè)，仍存在靈敏度不足的問題。

表面等離子體耦合發(fā)射是一種新穎的表面增強(qiáng)光學(xué)技術(shù)，連續(xù)金屬膜表面的激發(fā)態(tài)分子和表面等離子體之間的相互作用會(huì)引發(fā)表面等離子體振蕩，通過物鏡或者棱鏡耦合后在發(fā)射光波長對(duì)應(yīng)的表面等離子共振角處形成定向輻射。SPCE具有高度定向發(fā)射性、偏振性、波長分辨性、距離依賴和背景抑制性等特點(diǎn)，使其能有效的提高光信號(hào)的收集效率、檢測(cè)靈敏度和選擇性，近年來受到了越來越多研究者的關(guān)注。基于棱鏡構(gòu)型的SPCE成像和光譜在儀器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)方面的研究得到了迅速的發(fā)展。目前，基于棱鏡構(gòu)型的SPCE成像和光譜檢測(cè)裝置，雖然可以同時(shí)獲取樣品的SPCE熒光成像、光譜信息，但是其檢測(cè)范圍大，無法對(duì)微區(qū)尺寸的樣品進(jìn)行檢測(cè)，限制了SPCE分析技術(shù)在更小尺度上的應(yīng)用。而另方面，基于物鏡構(gòu)型的SPCE技術(shù)，雖然可以得到微區(qū)尺度樣品的成像信息，但是目前還無法獲得樣品對(duì)應(yīng)微區(qū)的光譜信息。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供基于物鏡耦合型的表面等離子體耦合發(fā)射定向增強(qiáng)型顯微熒光成像與光譜檢測(cè)方法及裝置，是一種新穎的具有微區(qū)尺度上的空間選擇和定向增強(qiáng)功能的SPCE顯微熒光成像和光譜檢測(cè)方法及裝置。

本發(fā)明將普適的耦合策略SPCE同時(shí)應(yīng)用于熒光成像和光譜，結(jié)合顯微鏡裝置，基于SPCE具有的高度定向性，以物鏡作為耦合元件，通過在激發(fā)光光路設(shè)置半波片以獲得所需偏振性激發(fā)光，其在經(jīng)過二向色濾鏡反射后以特定的表面等離子體共振角射入位于金屬納米薄膜上的樣品，發(fā)射的熒光信號(hào)由同一物鏡收集并再次經(jīng)過二向色濾鏡過濾掉激發(fā)光，定向激發(fā)和全收集大大提高了信號(hào)收集效率和檢測(cè)靈敏度。與棱鏡構(gòu)型的SPCE熒光成像與光譜檢測(cè)裝置收集的大范圍信號(hào)相比，本發(fā)明是以物鏡作為耦合器件，可以實(shí)現(xiàn)樣品更小范圍，即微區(qū)尺度的熒光成像與光譜信號(hào)采集。SPCE顯微熒光成像和光譜檢測(cè)方法及裝置在提高信號(hào)檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，還可以實(shí)現(xiàn)樣品同一微區(qū)高質(zhì)量的熒光成像以及光譜信息的獲取，為樣品低含量感興趣微區(qū)的研究提供了更加高效、可靠的檢測(cè)手段。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是：

一種基于物鏡耦合型的表面等離子體耦合發(fā)射定向增強(qiáng)型顯微熒光成像與光譜檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法采用的檢測(cè)裝置包括激發(fā)光模塊、定向激發(fā)SPCE顯微鏡模塊、SPCE顯微熒光成像模塊和SPCE顯微熒光光譜模塊；所述定向激發(fā)SPCE顯微鏡模塊包括半波片、樣品、物鏡、二向色濾鏡和反射鏡；所述SPCE顯微熒光成像模塊包括成像用檢測(cè)器；所述SPCE顯微熒光光譜模塊包括定位狹縫、單色儀和光譜檢測(cè)器；所述檢測(cè)方法包括：