[發明專利]一種識別大口黑鱸虹彩病毒的ssDNA核酸適配體及其應用

有效

• 申請號: 202011560117.7
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112522274B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 秦啟偉;張欣悅;王劭雯;黃曉紅;劉嘉昕;王立群;張澤妙
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;G01N33/569
• 代理公司: 廣州文智專利代理事務所(特殊普通合伙) 44469
• 代理人: 張濤

本發明涉及水產病毒檢測技術領域，公開了一種識別大口黑鱸虹彩病毒的ssDNA核酸適配體，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～3所示，該核酸適配體具有高特異性、高親和力、無細胞毒性、易對核酸適配體的不同部位進行修飾和取代以及易于保存的優點，且本發明提供的核酸適配體的預測二級結構中具有獨特的莖環結構，結構穩定，與靶標結合能力強，因此適用于制備大口黑鱸虹彩病毒檢測探針、藥物載體以及應用于藥物的分離與純化中，有利于針對大口黑鱸虹彩病毒實現快速高效的識別檢測或治療，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明涉及水產病毒檢測技術領域，更具體的，涉及一種識別大口黑鱸虹彩病毒的ssDNA核酸適配體及其應用。

背景技術

大口黑鱸是重要的淡水養殖魚類之一，因其生長快、營養高、肉質鮮美而在世界范圍內廣泛養殖。大口黑鱸虹彩病毒(Largemouth bass virus，LMBV)是從患病大口黑鱸中分離到的病毒性病原，致死率高。LMBV是一種核質型雙鏈DNA病毒，隸屬于虹彩病毒科蛙病毒屬。LMBV感染大口黑鱸引起的典型癥狀包括昏睡、體內外出血和臟器腫大等。近幾年，大規模的LMBV感染在大口黑鱸的養殖中時有發生，造成了巨大的經濟損失，并威脅大口黑鱸養殖業的健康發展。然而，目前尚未有治療LMBV感染的有效藥物。因此，目前急需開發新型的分子用于快速診斷和治療LMBV感染。

核酸適配體(aptamer)是一種單鏈的寡核苷酸鏈(DNA或RNA)，能夠通過三級結構折疊而特異性地與靶標結合，靶標范圍廣泛，可以是蛋白、病毒、細菌、寄生蟲或者細胞。核酸適配體通常是通過指數富集的配基系統進化技術篩選獲得。核酸適配體具有高親和力和特異性，其解離常數(K_d)通常在納摩爾或皮摩爾級別，因此被稱為“分子抗體”。抗體通常需要復雜的制備流程，而核酸適配體能夠在體外大量合成，穩定性高、成本低，而且還可以方便地進行化學修飾來進行優化。目前，高特異性和親和力的核酸適配體已被廣泛應用于病毒研究中，例如臨床診斷、成像、抗病毒治療和病毒致病機理研究中，大部分核酸適配體能夠抑制病毒感染，并且還能應用于病毒檢測技術開發、藥物或siRNA運載治療等。

目前針對部分水生病毒，科研人員已經篩選出了核酸適配體，比如牙鲆彈狀病毒、石斑魚虹彩病毒、神經壞死癥病毒等，但是研究的種類還是較少，尤其是目前鮮見關于LMBV核酸適配體的報道，因此缺乏針對LMBV的快速檢測以及有效防治手段。

綜上所述，研究和篩選用于識別大口黑鱸虹彩病毒的ssDNA核酸適配體實為必要。

發明內容

本發明提供的一種識別大口黑鱸虹彩病毒的ssDNA核酸適配體及其應用，主要用于解決目前關于LMBV核酸適配體的研究報道較少，缺乏針對LMBV的快速檢測手段的問題。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明提供的識別大口黑鱸虹彩病毒的ssDNA核酸適配體的核苷酸序列如SEQ IDNO:1～3中任意一條所示。

作為本發明的識別大口黑鱸虹彩病毒的ssDNA核酸適配體的一種修飾或改進，所述ssDNA核酸適配體的核苷酸序列上的至少一個位置被磷酸化、巰基化、甲基化、氨基化或同位素化。

作為本發明的識別大口黑鱸虹彩病毒的ssDNA核酸適配體的一種修飾或改進，所述ssDNA核酸適配體的核苷酸序列上結合有生物素、地高辛、熒光素。

本發明提供的識別大口黑鱸虹彩病毒的ssDNA核酸適配體的篩選方法包括以下步驟：

S1.構建隨機起始文庫(Library)及設計PCR引物：

構建的隨機起始文庫(Library)的核苷酸序列為：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCA(N45)TGGACACGGTGGCTTAGT-3'，其由45bp的中間隨機序列(N45)和兩端的固定序列構成，其中N代表A、T、C、G四個堿基中的一個；