[發明專利]一種有效脫除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的方法

在審

• 申請號: 202011557028.7
• 申請日: 2020-12-25
• 公開（公告）號: CN112616665A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 劉蘭英;張秦;張軍民;李春玲
• 申請（專利權）人: 北京市海淀區植物組織培養技術實驗室;北京海花生物科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G24/28;A01G24/15;C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種有效脫除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的方法，所述方法包括下述步驟：

(1)、莖尖培養脫毒：

剪取甘薯芽端頂部2cm～3cm長的莖段，剪去已經展開的葉片，倒入洗衣粉用刷子進行洗滌，流水沖洗30min；在無菌操作臺上用70％的酒精浸泡30s，再用2％的次氯酸鈉消毒5分鐘，無菌水沖洗3次，得到消毒后的芽段；

在解剖鏡下對消毒后的芽段進行剝離莖尖處理，剪去較小未展開葉片和較大的葉原基，切下帶有1～2個葉原基的生長點，長度為0.2mm～0.3mm，用解剖針將莖尖挑到裝有培養基的三角瓶中進行莖尖培養，每接種一個莖尖換一次手術刀及解剖針，以降低污染；莖尖培養的培養基為MS基本培養基加入6-BA 1.0mg/L、IAA 0.5mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂6g/L，pH值5.8；培養條件為溫度25℃、光照強度2000Lx、光照時間12h/d；培養30d后轉到MSO培養基分化成苗；

(2)、病毒檢測：

當步驟(1)中培養的莖尖苗分化成兩棵以上，采葉子4～6片采用RT-PCR檢測甘薯羽狀斑駁病毒和甘薯卷葉病毒；所述RT-PCR的程序為：預變性：94℃ 5min；變性：94℃ 30s；復性：60℃ 30s；延伸：72℃ 60s；30個循環；最后延伸：72℃ 10min；

經檢測得到的脫毒苗直接用于組培苗生產；經檢測得到的帶毒的組培苗進入高溫處理和抗病毒藥劑處理；

(3)、高溫處理或抗病毒藥劑處理：

對步驟(2)中經檢測得到的帶毒的組培苗進行高溫處理或抗病毒藥劑處理；

其中高溫處理的具體步驟為：在40℃條件下處理2h～8h后，按照步驟(2)進行病毒檢測，得到脫除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的組培苗；

其中抗病毒藥劑處理的具體步驟為：在帶毒的組培苗培養基中分別加入50mg/L～200mg/L的毒氟磷、阿泰靈、新奧甘肽或寧南霉素培養1個月～5個月，按照步驟(2)進行病毒檢測，得到脫除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的組培苗。

2.根據權利要求1所述的一種有效脫除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的方法，其特征在于，在步驟(1)莖尖培養脫毒步驟之前還包括接種材料處理步驟，具體步驟為：將甘薯薯塊萌發苗或扦插苗進行盆栽，盆栽基質為草炭與蛭石以1∶1比例混合；甘薯苗達到20cm～30cm時，開始取樣開展莖尖培養。

3.根據權利要求1所述的一種有效脫除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的方法，其特征在于，所述步驟(2)中RT-PCR檢測的引物為：

SPFMV F 5-GGATTAYGGTGTTGACGAC-3，

SPFMV R 5-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3；

SPLCV F 5-CCCCKGTGCGWRAATCCAT-3，

SPLCV R 5-ATCCVAAYWTYCAGGGAGCTAA-3。