[發(fā)明專利]一株不產(chǎn)桔霉素的重組紅曲菌及其構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011553310.8
• 申請(qǐng)日: 2020-12-24
• 公開（公告）號(hào): CN112608853A
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 嘉曉勤;趙天佑;何猛;陳小龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/15
• 分類號(hào): C12N1/15;C12N15/80;C12R1/645
• 代理公司: 浙江千克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

1.一株不產(chǎn)桔霉素的重組紅曲菌——紫色紅曲菌浙工紅曲3號(hào)(Monascus purpureus浙工紅曲3號(hào))，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，分類名稱為：Monascus purpureus，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2020728，保藏日期為2020年11月12日。

2.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述不產(chǎn)桔霉素的重組紅曲菌的方法，所述方法包括：

(1)以紅曲菌A基因組為模板，分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出pksCT基因的UTL核酸片段和UTR核酸片段：

(2)以根瘤農(nóng)桿菌載體pPZP201為母核，與核酸替代片段WH連接得到pWH2雙元載體，然后用XbaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切得到線性化pWH2載體；使用C112重組酶對(duì)線性化pWH2載體和UTL進(jìn)行重組得到pWH2::UTL；SpeⅠ限制性內(nèi)切酶酶切pWH2::UTL，使用C112重組酶對(duì)線性化載體和UTR進(jìn)行重組得到pWH2::ΔpksCT；所述核酸替代片段WH順次包括以下序列：左LoxP序列、xyn1啟動(dòng)子、Cre酶序列、NOS終止子、hph序列和右LoxP；

(3)將重組載體pWH2::ΔpksCT轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌AGL-1中，將含有重組載體pWH2::ΔpksCT的根瘤農(nóng)桿菌AGL-1利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化紅曲菌，潮霉素抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子,在潮霉素抗性平板上不生長(zhǎng)而在不含潮霉素抗性平板上生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證成功的轉(zhuǎn)化子即為所述重組紫色紅曲菌。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述UTL核酸片段序列如SEQ ID NO.9所示，所述UTR核酸片段序列如SEQ ID NO.10所示。

4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述核酸替代片段WH序列如SEQ ID NO.11所示。