[發明專利]一種提高透明質酸產率的方法

有效

• 申請號: 202011550107.5
• 申請日: 2020-12-24
• 公開（公告）號: CN112553272B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 張天萌;戚明;劉金釗;羅德學;劉英杰;張由恒;王景;郝井坤
• 申請（專利權）人: 華熙生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26;C12R1/46;C12R1/125;C12R1/15;C12R1/19
• 代理公司: 北京唐頌永信知識產權代理有限公司 11755
• 代理人: 劉偉

本發明公開了一種提高透明質酸產率的方法，所述方法在生產透明質酸的發酵液中根據發酵液的溶氧水平添加透明質酸酶，所述發酵液是在發酵培養基中加入合成透明質酸的菌進行發酵得到的。本發明的方法可以實現一步法制備小分子透明質酸，該方法可以應用于任何發酵合成透明質酸的菌株，和任何可以降解透明質酸的酶類。另外，本發明通過添加吐溫80，在一定程度上保護細胞，解決了前期透明質酸酶對菌體的不利影響，降低透明質酸酶對細胞的損傷。且在發酵中添加透明質酸酶，可使發酵液粘度下降，傳質效率提高，有利于提高前期透明質酸的生物合成速率，從而提高了透明質酸的產率。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及提高透明質酸產率的方法。

背景技術

透明質酸(hyaluronic acid，簡稱HA)，俗稱玻尿酸，是一種由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖為重復雙糖單位，通過β(1-3)和β(1-4)糖苷鍵交替連接而成的大分子黏性多糖，1934年由Meyer等人從牛玻璃球眼中首次提取獲得。透明質酸以其獨特的分子結構和理化性質在機體內顯示出多種重要的生理功能，如潤滑關節，調節血管壁的通透性，調節蛋白質，水電解質擴散及運轉，促進創傷愈合等。尤為重要的是，透明質酸具有特殊的保水作用，是目前發現的自然界中保濕性最好的物質，被稱為理想的天然保濕因子，由于HA具有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，同時無任何免疫原性和毒性，被廣泛應用于化妝品、食品和醫藥等行業領域。

根據文獻研究表明，分子量大小對HA的生物活性影響較大，不同分子量范圍的HA卻表現出截然不同的生理學功能。高分子量的HA(Mr2×10⁶kDa)由于具有較好的粘彈性、保濕性、抑制炎性反應、潤滑等功能，可應用于高端化妝品行業、眼科手術黏彈劑和關節腔內注射治療。中等分子量的HA(介于1×10⁵-10⁶kDa)具有良好的保濕性、潤滑和藥物緩釋作用，可廣泛用于化妝品、滴眼液、皮膚燒傷愈合及術后防粘連。低分子量的HA(低于1×10⁴kDa)和寡聚透明質酸，表現出非常強的生物活性，具有抑制腫瘤擴散、促進創傷愈合、促進骨和血管生成、免疫調節等作用，且易于滲透到真皮中，是免疫細胞、細胞因子的激活劑。因此，小分子透明質酸在食品保健、化妝品以及臨床醫療領域具有廣闊的應用前景。

當前制備小分子量HA的方法主要集中在物理法和化學法。物理法主要為加熱、機械剪切力、紫外線、超聲波、Co₆₀照射、γ-射線輻射等方法促使HA發生降解。物理降解法處理過程簡單，產品易于回收。但是，這些方法都會帶來一定的影響，例如加熱法易使HA變色，紫外和超聲效率較低等，且產生的小分子分子量范圍較大，產品穩定性較差。化學降解方法有水解法和氧化降解法，水解法分酸水解(HCl)和堿水解(NaOH)，氧化降解常用的氧化劑為次氯酸鈉(NaClO)和過氧化氫(H₂O₂)。化學降解法引入了化學試劑，反應條件復雜，易影響HA性質，不易于產品的純化，同時其會產生大量的工業廢水。

采用酶解法制備分子量分布集中的小分子透明質酸，常用技術是在高分子量透明質酸水溶液中加入一定量透明質酸酶，并控制水解時間。通過控制加入透明質酸酶的量和水解時間，根據水解分子量下降規律，可以制備出分子量分布集中的小分子HA，包括水解終產物透明質酸四糖和六糖。

CN 106367459 A一種制備不同分子量寡聚HA的方法，其在重組枯草芽孢桿菌的發酵過程中添加水蛭來源的透明質酸酶，制備了低分子量HA，同時提高了發酵產率。但是其說明在溶氧過高的情況下添加透明質酸酶會造成產率下降，且此發酵時間較短，不能實現最大化的利用設備。如果發酵時間能夠延長，則可以最大化的利用設備，降低成本。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明提供一種提高透明質酸產率的方法，從而克服早期添加酶，透明質酸產率下降的問題，并延長了發酵時間。

具體來說，本發明涉及如下方面：