[發(fā)明專利]一種副溶血性弧菌檢測(cè)裝置及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011543562.2
• 申請(qǐng)日: 2020-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN112760221B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳佳琪;李昱權(quán);孫雨玘;葉海芬;蔣晨豪;寧景苑;張建鋒;易曉梅;惠國(guó)華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/06
• 分類號(hào): C12Q1/06;C12M1/42;C12M1/38;C12M1/34;C12M1/00;G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 杭州天麟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33374
• 代理人: 占宇

1.一種非疾病診斷目的的副溶血性弧菌檢測(cè)裝置的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)裝置包括計(jì)算機(jī)(1)、數(shù)據(jù)采集器(2)、電化學(xué)工作站(3)、第一檢測(cè)機(jī)構(gòu)和第二檢測(cè)機(jī)構(gòu)，所述第一檢測(cè)機(jī)構(gòu)包括第一底座(4)，所述第一底座(4)上設(shè)有第一檢測(cè)容器(5)、第一檢測(cè)模塊以及驅(qū)動(dòng)第一檢測(cè)模塊升降的第一升降器(6)，所述第一檢測(cè)模塊包括第一導(dǎo)軌(7)、可沿第一導(dǎo)軌(7)滑動(dòng)的第一滑塊(8)以及驅(qū)動(dòng)第一滑塊(8)滑動(dòng)的第一驅(qū)動(dòng)模塊(9)，所述第一滑塊(8)底部連接有第一支架(10)，所述第一支架(10)底部從左至右等間距設(shè)有m個(gè)第一連接座(15)，所述第一連接座(15)上可拆卸連接有第一工作電極(11)，所述第一導(dǎo)軌(7)底部可拆卸連接有第一對(duì)電極(12)、第一參比電極(13)，所述第一對(duì)電極(12)、第一參比電極(13)位于第一檢測(cè)容器(5)的正上方，所述第一支架(10)上還設(shè)有第一多路數(shù)據(jù)選擇器(14)，所述第一多路數(shù)據(jù)選擇器(14)的m個(gè)輸入端分別與m個(gè)第一連接座(15)電連接，所述第一連接座(15)與連接的第一工作電極(11)電連接，所述第二檢測(cè)機(jī)構(gòu)包括第二底座(16)，所述第二底座(16)上設(shè)有第二檢測(cè)容器(17)、第二檢測(cè)模塊以及驅(qū)動(dòng)第二檢測(cè)模塊升降的第二升降器(18)，所述第二檢測(cè)模塊包括第二導(dǎo)軌(19)、可沿第二導(dǎo)軌(19)滑動(dòng)的第二滑塊(20)以及驅(qū)動(dòng)第二滑塊(20)滑動(dòng)的第二驅(qū)動(dòng)模塊(21)，所述第二滑塊(20)底部連接有第二支架(22)，所述第二支架(22)底部從左至右等間距設(shè)有m個(gè)第二連接座(27)，所述第二連接座(27)上可拆卸連接有第二工作電極(23)，所述第二導(dǎo)軌(19)底部可拆卸連接有第二對(duì)電極(24)、第二參比電極(25)，所述第二對(duì)電極(24)、第二參比電極(25)位于第二檢測(cè)容器(17)的正上方，所述第二支架(22)上還設(shè)有第二多路數(shù)據(jù)選擇器(26)，所述第二多路數(shù)據(jù)選擇器(26)的m個(gè)輸入端分別與m個(gè)第二連接座(27)電連接，所述第二連接座(27)與連接的第二工作電極(23)電連接，所述電化學(xué)工作站(3)分別與第一多路數(shù)據(jù)選擇器(14)的輸出端、第一對(duì)電極(12)、第一參比電極(13)、第二多路數(shù)據(jù)選擇器(26)的輸出端、第二對(duì)電極(24)、第二參比電極(25)、數(shù)據(jù)采集器(2)的輸入端電連接，所述計(jì)算機(jī)(1)分別與數(shù)據(jù)采集器(2)的輸出端、第一升降器(6)、第二升降器(18)、第一驅(qū)動(dòng)模塊(9)、第二驅(qū)動(dòng)模塊(21)、第一多路數(shù)據(jù)選擇器(14)的控制端、第二多路數(shù)據(jù)選擇器(26)的控制端電連接，所述第一工作電極(11)上未培育副溶血性弧菌抗原，所述第二工作電極(23)上培育有副溶血性弧菌抗原，其特征在于，包括以下步驟：

S1：配置不同濃度的副溶血性弧菌懸浮液，檢測(cè)每個(gè)濃度的副溶血性弧菌懸浮液對(duì)應(yīng)的特征值Y，將這些值進(jìn)行擬合得到濃度計(jì)算公式：Y＝0.2+0.1×LgX，X為副溶血性弧菌的濃度；

S2：取待測(cè)副溶血性弧菌懸浮液，檢測(cè)其對(duì)應(yīng)的特征值Y，根據(jù)濃度計(jì)算公式：Y＝0.2+0.1×LgX，計(jì)算出待測(cè)副溶血性弧菌懸浮液的濃度；

所述檢測(cè)某個(gè)濃度的副溶血性弧菌懸浮液對(duì)應(yīng)的特征值Y的方法包括以下步驟：

M1：將第一檢測(cè)模塊上的m個(gè)未參與檢測(cè)過的第一工作電極上都滴加2.5μl該濃度的副溶血性弧菌懸浮液并靜置25分鐘，將第二檢測(cè)模塊上的m個(gè)未參與檢測(cè)過的第二工作電極上都滴加2.5μl該濃度的副溶血性弧菌懸浮液并靜置25分鐘；

M2：采用同樣方法對(duì)該濃度的副溶血性弧菌懸浮液進(jìn)行m次檢測(cè)，每次檢測(cè)的檢測(cè)步驟如下：

將第一對(duì)電極、第一參比電極、未參與檢測(cè)過的第一工作電極插入第一檢測(cè)容器內(nèi)的緩沖溶液中，第一對(duì)電極、第一參比電極、未參與檢測(cè)過的第一工作電極構(gòu)成第一電化學(xué)傳感器陣列；

將第二對(duì)電極、第二參比電極、未參與檢測(cè)過的第二工作電極插入第二檢測(cè)容器內(nèi)的緩沖溶液中，第二對(duì)電極、第二參比電極、未參與檢測(cè)過的第二工作電極構(gòu)成第二電化學(xué)傳感器陣列；

采用循環(huán)伏安法從小到大依次切換n種不同的掃描速率進(jìn)行檢測(cè)，得到n個(gè)還原峰電流差值ΔIp_w1、ΔIp_w2…ΔIp_wn，ΔIp_wn＝Ip1_wn-Ip2_wn，ΔIp_wn為第w次檢測(cè)中第n種掃描速率下的還原峰電流差值，Ip1_wn為第w次檢測(cè)中第n種掃描速率下第一電化學(xué)傳感器陣列對(duì)應(yīng)的還原峰電流值，Ip2_wn為第w次檢測(cè)中第n種掃描速率下第二電化學(xué)傳感器陣列對(duì)應(yīng)的還原峰電流值，1≤w≤m；

M3：根據(jù)m次檢測(cè)的檢測(cè)數(shù)據(jù)構(gòu)建出特征矩陣D，

M4：將特征矩陣D的每行數(shù)據(jù)進(jìn)行二次樣條插值，得到m個(gè)與每行數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的曲線x(t)，對(duì)m個(gè)曲線x(t)進(jìn)行同樣的數(shù)據(jù)處理，得到m個(gè)特征值F，對(duì)每個(gè)曲線x(t)進(jìn)行的數(shù)據(jù)處理包括以下步驟：將x(t)帶入非線性定向飽和共振模型

中，平緩反饋級(jí)聯(lián)穩(wěn)態(tài)勢(shì)函數(shù)：

檢測(cè)信號(hào)載入分量ing(t)＝cos(kt+η)+x(t)，

其中，t為插值變量，k為實(shí)參數(shù)，η為實(shí)參數(shù)，nois(t)為功率譜密度函數(shù)不平坦的有色噪聲，P為實(shí)參數(shù)，Q為實(shí)參數(shù)，a、b、c為實(shí)數(shù)，δ為平緩延時(shí)參數(shù)，

調(diào)節(jié)t的值，非線性定向飽和共振模型在t＝t_r點(diǎn)位達(dá)到共振，計(jì)算共振狀態(tài)的特征值F：

M5：將m個(gè)特征值F取平均，得到的平均值即為特征值Y的值；所述第二工作電極上培育副溶血性弧菌抗原的方法如下：

N1：將銀漿SL和海藻酸鈉SA按照質(zhì)量比1∶3比例混合制成10ml溶膠水溶液，接著超聲分散15min，稱取5mg的氧化石墨烯GO和1mg的氨基功能化的有機(jī)金屬框架材料NH₂-CuBTC溶解于溶膠水溶液中，超聲震蕩25min，得到GO/NH₂-CuBTC/SL/SA混合液，取1.5μL的GO/NH₂-CuBTC/SL/SA混合液滴加到第二工作電極表面，于室溫干燥5h，在第二工作電極上形成一層GO/NH₂-CuBTC/SL/SA薄膜；

N2：用PBS緩沖液將副溶血性弧菌多克隆抗體溶液稀釋300倍后取4μl修飾在干燥后的第二工作電極上，在干燥皿中靜置干燥；

N3：取3.5μl副溶血性弧菌抗原溶液滴涂在第二工作電極上，在30℃條件下培育25min，用蒸餾水洗掉第二工作電極上未結(jié)合的副溶血性弧菌抗原，晾干；

所述副溶血性弧菌抗原溶液的制備方法如下：將濃度為2×10⁸cfu/ml～2×10⁹cfu/ml的副溶血性弧菌用8％～12％的福爾馬林在25℃～39℃滅活，滅活后離心去除福爾馬林，涂布平板進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，確定無菌后，沉淀用等體積無菌生理鹽水重新懸浮，從而得到副溶血性弧菌抗原溶液。