[發明專利]一種胎盤亞全能干細胞的分離培養方法

有效

• 申請號: 202011541973.8
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN112592885B
• 公開（公告）日: 2022-06-17
• 發明（設計）人: 趙春華;李鑄男;洪濤
• 申請（專利權）人: 山東華領奧源生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司 11514
• 代理人: 袁克來

本發明公開了一種胎盤亞全能干細胞的分離培養方法，包括如下步驟：從健康胎盤上剝離羊膜并進行清洗，隨后剪成小塊，得到羊膜樣品；將羊膜樣品置于膠原酶I溶液中進行消化并去除消化液，再進行清洗，得到消化樣品；將消化樣品置于胰蛋白酶溶液中進行酶解、分離，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清終止酶解、過150目篩，收集濾液；將濾液進行離心、過濾，再添加DMEM培養基進行重懸，得到胎盤亞全能干細胞種子；將胎盤亞全能干細胞種子進行原代培養，得到原代胎盤亞全能干細胞；將原代胎盤亞全能干細胞接種至傳代培養基中進行傳代培養，得到傳代胎盤亞全能干細胞，并進行冷凍保存；該方法得到的干細胞具有較高的純度和得率，且增殖快，活性高。

技術領域

本發明涉及干細胞技術領域，具體涉及一種胎盤亞全能干細胞的分離培養方法。

背景技術

胎盤(placenta)是胎兒與母體之間物質交換的重要器官，是人類妊娠期間由胚胎胚膜和母體子宮內膜聯合長成的母子間組織結合器官。胎兒在子宮中發育，依靠胎盤從母體取得營養，而雙方保持相當的獨立性。胎盤還合成多種激素、酶和細胞因子等，以維持正常妊娠。胎盤還是一味中藥，稱之為紫河車，又叫人胎衣、胞衣、衣胞、胎衣、胎膜。

然而，胎盤中年可以分離出大量胎盤亞全能干細胞，其發育階段與胚胎干細胞接近，具備全能干細胞的生物學特征，可以定向分化成上皮干細胞、神經干細胞、心肌細胞、骨細胞等等。

現有胎盤亞全能干細胞的分離方法大多包括羊膜處理、酶解和離心，但現有分離方法分離得到的胎盤亞全能干細胞中存有雜細胞較多，導致純度較低，而且由于消化不徹底，導致得率較低。

此外，分離得到的胎盤亞全能干細胞需要經過培養擴增得到足夠的胎盤亞全能干細胞，然而，隨著胎盤亞全能干細胞的擴增代數的增加，導致胎盤亞全能干細胞的活力、分化能力降低。

發明內容

本發明的目的在于提供一種胎盤亞全能干細胞的分離培養方法，該分離培養方法分離得到的胎盤亞全能干細胞具有較高的純度和得率；而且具有增值快和較高的分化活力。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

本發明實施例第一方面提供一種胎盤亞全能干細胞的分離培養方法，所述分離培養方法包括如下步驟：

(a)從健康胎盤上剝離羊膜，并采用生理鹽水對羊膜進行清洗，隨后將羊膜剪成1～4mm³的小塊，得到羊膜樣品；

(b)將羊膜樣品置于膠原酶I溶液中進行消化并去除消化液，再采用生理鹽水進行清洗，得到消化樣品；

(c)將消化樣品置于胰蛋白酶溶液中進行酶解、分離，得到酶解液，再向酶解液中添加胎牛血清終止酶解、過150目篩，收集濾液；

(d)將濾液進行離心、過濾，再添加DMEM培養基進行重懸，得到胎盤亞全能干細胞種子；

(e)將胎盤亞全能干細胞種子進行原代培養，得到原代胎盤亞全能干細胞；

(f)將原代胎盤亞全能干細胞接種至傳代培養基中進行傳代培養，得到傳代胎盤亞全能干細胞，并進行冷凍保存。

優選地，所述膠原酶I溶液中膠原酶I的濃度為1～2mg/ml。

優選地，所述消化溫度為37℃，消化時間為10～20min。

優選地，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶濃度為0.2％。

優選地，所述酶解溫度為37℃，酶解是時間為30～40min。

優選地，所述原代培養包括：