[發(fā)明專利]一種適用于露濕漆斑菌A553的CRISPR/Cas9載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011538861.7
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN112538496A
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉偉;章衛(wèi)民;朱牧孜;岑由飛;李賽妮;劉洪新;李浩華
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/113;C12N1/15;C12R1/645
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 朱雙;劉明星

本發(fā)明公開了一種適用于露濕漆斑菌A553的CRISPR/Cas9載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建了適用于植物內(nèi)生真菌露濕漆斑菌A553的CRISPR/Cas9載體，并對新型單端孢霉烯的關(guān)鍵生物合成基因Tri18進行敲除，并通過代謝產(chǎn)物對比分析進一步驗證目的基因的功能，為后期解析露濕漆斑菌A553中單端孢霉烯trichothecenes生物機合成制奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)，促進trichothecenes類化合物在抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物方面的開發(fā)利用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于露濕漆斑菌A553的CRISPR/Cas9載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

露濕漆斑菌(Myrothecium roridum)A553是一種來源于藥用植物廣藿香的內(nèi)生真菌，露濕漆斑菌是大豆的主要致病真菌，對大豆產(chǎn)量造成了不可估量的損失。據(jù)報道單端孢霉烯毒素是一種含有大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的倍半萜類化合物，具有顯著的細胞毒活性，是露濕漆斑菌的毒力因子。本課題組前期從露濕漆斑菌(Myrothecium roridum)A553中分離得到了多種具有顯著細胞毒活性的單端孢霉烯類化合物，其中部分化合物具有一定的特異性抗腫瘤活性，具有開發(fā)成為特異性抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物的潛力。在此基礎(chǔ)上，本課題組對M.roridum A553進行了轉(zhuǎn)錄組及基因組測序，從中發(fā)掘了單端孢霉烯的生物合成基因簇。從中發(fā)掘了單端孢霉烯生物合成的相關(guān)基因Tri18，預(yù)測其編碼的酰基轉(zhuǎn)移酶在大環(huán)單端孢霉烯骨架形成過程中發(fā)揮重要作用，但其如何通過生物合成生成D型大環(huán)單端孢霉烯仍需進一步解析。因此，建立M.roridum A553的基因敲除體體系對于驗證單端孢霉烯的生物合成關(guān)鍵基因，進而解析其生物合成機制至關(guān)重要。

CRISPR/Cas9是近年來興起的由sgRNA骨架介導(dǎo)Cas9核酸酶對靶向基因切割，通過非同源末端修復(fù)和同源重組途徑使目的基因發(fā)生突變或缺失從而使目的基因失活的技術(shù)。研究者們不斷發(fā)掘了nCa9和Cas12a等技術(shù)以提高CRISPR/Cas9的特異性和基因編輯效率。激活誘導(dǎo)性胞苷脫氨酶與CRISPR/Cas9結(jié)合可使堿基C變?yōu)門，從而使編碼基因突變或失活，這比通過基因突變和基因刪除具有更高的效率。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于構(gòu)建簡單，基因敲除效率相對較高，成本較低等優(yōu)點已經(jīng)在哺乳動物細胞、干細胞和植物等真核細胞的基因組編輯方面有著十分廣泛的應(yīng)用，而由于植物內(nèi)生真菌獨特生境導(dǎo)致及相對復(fù)雜的遺傳背景，且CRISPR/Cas9系統(tǒng)在絲狀真菌中敲除效率相對較低，目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)尚未應(yīng)用于露濕漆斑菌M.roridum A553目的基因敲除。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服目前露濕漆斑菌(Myrothecium roridum)A553缺乏有效的遺傳操作手段的現(xiàn)狀，提供一種適用于露濕漆斑菌A553的CRISPR/Cas9載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種適用于露濕漆斑菌A553的CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

在pFC332載體基礎(chǔ)上，設(shè)計Tri18基因的靶點序列5'-GGGTGAAGATGGCGATTGTT-3'，設(shè)計并分別擴增5S rRNA片段和含靶點序列的sgRNA片段，然后以5S rRNA片段和含靶點序列的sgRNA片段為混合模板進行融合PCR，得到5S rRNA-Tri18-sgRNA片段；

用限制性內(nèi)切酶PacI和BglII雙酶切pFC332載體和5SrRNA-Tri18-sgRNA片段，然后用T4 DNA連接酶將5S rRNA-Tri18-sgRNA片段連接至pFC332載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細胞，Amp抗性篩選，擴增5S rRNA-Tri18-sgRNA片段進行菌液PCR驗證，由此獲得適用于露濕漆斑菌A553的CRISPR/Cas9載體。

優(yōu)選，所述的5S rRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的含靶點序列的sgRNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。