[發(fā)明專利]一種針對K1莢膜大腸桿菌的噬菌體內(nèi)切唾液酸酶及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011538467.3
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN112522236A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴建君;湯芳;鞏倩雯
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/24
• 分類號(hào): C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;A23L29/00;A61K38/47;A61P31/04
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 杜靜;徐冬濤

本發(fā)明公開了一種針對K1莢膜大腸桿菌的噬菌體內(nèi)切唾液酸酶及其應(yīng)用。所述內(nèi)切唾液酸酶核苷酸序列為Seq ID No.1,氨基酸序列為Seq ID No.2所示。該裂解酶具有針對K1莢膜大腸桿菌的特性，可以作為有效的抗菌成分來特異性滅活這一類細(xì)菌，并且能夠在疾病診斷、醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工等方面發(fā)揮作用；該酶制劑可以單獨(dú)或復(fù)配使用，能夠特異性滅活某些細(xì)菌，為細(xì)菌感染的防治和食源性細(xì)菌污染提供安全可靠的酶制劑來源。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及了一種針對K1莢膜大腸桿菌的噬菌體的內(nèi)切唾液酸酶的制備方法及其作為抑菌劑成分在醫(yī)療衛(wèi)生和食品加工等方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

大腸桿菌(Escherichia coli)為埃希氏菌屬(Escherichia)代表菌，它包括動(dòng)物或人共生菌株和致病性菌株。致病性大腸桿菌給人和動(dòng)物健康造成危害，也給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的損失。引起新生兒細(xì)菌性腦膜炎的腸道外致病性大腸桿菌大多都有K1莢膜，它能夠穿過血腦屏障致病，而K1莢膜則是主要致病因子。主要成分是由2，8唾液酸連接成的多聚體-多聚唾液酸。盡管使用了先進(jìn)的抗生素，但與大腸桿菌K1腦膜炎相關(guān)的發(fā)病率和死亡率在過去幾十年中保持不變。另外，由于近來耐藥大腸桿菌K1株的激增，死亡率可能會(huì)進(jìn)一步顯著增加。

近年來，噬菌體治療被認(rèn)為是能夠緩解多重耐藥菌嚴(yán)峻形式的有效方案。由于噬菌體存在廣泛，種類多樣，宿主特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，可以作為治療細(xì)菌感染的新型生物制劑。目前已經(jīng)分離到了多種具有多糖專一性的噬菌體，可以特異性降解細(xì)菌胞外多糖，從而能夠使細(xì)菌毒力下降。K1專一性噬菌體可以特異性降解K1莢膜，從而使其毒力減弱，致病性減弱。同時(shí)，這些噬菌體可用于大腸桿菌的分型檢測。而K1專一性噬菌體上的尾部蛋白可以發(fā)揮唾液酸內(nèi)切酶的功能來專一性的分解多聚唾液酸。專利96195235.0中提及了在早期發(fā)現(xiàn)的內(nèi)切唾液酸酶，但是沒有進(jìn)行抑菌功能的驗(yàn)證。本專利中所描述的內(nèi)切唾液酸酶的基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)均與其有較大差異，制備方法也有所不用。且本專利中描述了該酶的抑菌效果，擴(kuò)寬了應(yīng)用范圍。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的之一在于提供了一種針對K1莢膜大腸桿菌具有裂解作用的新型噬菌體內(nèi)切唾液酸酶及其制備和應(yīng)用。該唾液酸內(nèi)切酶可以專一性降解多聚唾液酸，而且具有一定程度的抑菌功能，具有特異性強(qiáng)、安全無毒、水溶性好的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明目的之二還提供了上述內(nèi)切唾液酸酶的制備方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種針對K1莢膜大腸桿菌具有裂解作用的內(nèi)切唾液酸酶，氨基酸序列如Seq ID No.2所示，或者與只具有至少95％同源性的具有K1莢膜大腸桿菌裂解活性的酶。

本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明所述的內(nèi)切唾液酸酶的編碼基因。在一種具體的實(shí)施例中，本發(fā)明所述的編碼基因，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。需要說明的是，由于同一氨基酸可能有多種不同的密碼子來決定，所以編碼上述內(nèi)切唾液酸酶的核苷酸序列并不局限于Seq ID No.1所示的序列，也可以是由與Seq IDNo.1所示核苷酸序列突變一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成同義突變得到可編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種載體，該載體包含可編碼所述內(nèi)切唾液酸酶的編碼基因。

本發(fā)明還提供一種重組細(xì)胞，包含：可編碼所述內(nèi)切唾液酸酶的編碼基因，或者包含可編碼內(nèi)切唾液酸酶的編碼基因的載體。

在本發(fā)明的一種具體的實(shí)施例中，本發(fā)明還提供本發(fā)明所述內(nèi)切唾液酸酶的具體制備方法，包括以下步驟：

(1)根據(jù)目的基因序列(Seq ID No.1)及載體pET28a酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)帶有同源臂的擴(kuò)增引物；用PCR方法擴(kuò)增目的基因片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收；酶切載體也進(jìn)行膠回收；