[發(fā)明專利]一種檢測靈芝多糖含量的高通量方法

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• 申請日: 2020-12-22
• 公開（公告）號: CN112730285A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設計）人: 孫立權;郜玉欣;羅愛芹
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78;G01N1/38
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種檢測靈芝多糖含量的高通量方法，屬于生物分析技術領域。將酶標儀應用于檢測靈芝多糖的含量，在葡萄糖濃度10?100μg/mL范圍內，苯酚?硫酸法與蒽酮?硫酸法均有良好的線性關系。酶標儀檢測靈芝多糖具有高通量、節(jié)省樣品、縮短分析時間、可進行動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點。為靈芝多糖分析檢測提供了一個新方法。

技術領域

本發(fā)明公開了一種檢測靈芝多糖含量的高通量方法。該方法使用酶標儀，利用苯酚-硫酸法或者蒽酮-硫酸法對靈芝多糖進行高通量檢測，屬于生物分析技術領域。

背景技術

靈芝多糖是靈芝中重要有效成分，由三股單糖鏈構成的、具有螺旋狀立體構形(三級結構)的葡聚糖，其立體構型與脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)相似，是一種大分子化合物。具有降血糖、降血脂、抗血栓、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗輻射、抗腫瘤、促進血流循環(huán)、調節(jié)人體免疫功能等生物活性。由于靈芝多糖具有特有的生理活性和醫(yī)用價值，且安全無毒，被廣泛應用于醫(yī)藥、食品和化妝品行業(yè)。

目前，對靈芝多糖的含量分析主要用比色法和色譜法，也有報道，采用色譜與質譜聯(lián)用分析靈芝多糖的相對分子質量、化學式及結構。上述方法都有自己的特點和不足。特別是，大多數(shù)研究者采用比色法，無論是苯酚還是蒽酮都需要使用大量的濃硫酸作為檢測溶劑，并且測試樣品多，需要沸水浴煮樣品，準備和測試花費較長時間，測試后，產生大量酸性廢液，給環(huán)境或者廢棄物處理帶來較大壓力。

酶標儀是生物實驗室中常備的設備，一般可以使用96孔板等盛裝樣品進行檢測，并且具有溫度調節(jié)的功能，能夠對樣品進行恒溫加熱。在采用普通的分光光度計檢測多糖的教學和科研實驗中，我們設計了新檢測實驗方案，使用酶標儀來測量靈芝多糖的含量，可以一次測量多個樣品(由孔板上孔數(shù)量決定)，同時可以對樣品進行加熱，避免了在沸水浴中加熱的安全隱患，實現(xiàn)了靈芝多糖的高通量檢測。也節(jié)約了大量苯酚、蒽酮和硫酸等試劑，避免了大量酸性廢液的產生。

發(fā)明內容

本發(fā)明目的在于使用實驗室常用儀器——酶標儀，經(jīng)過實踐檢驗，設計并提供了一種高通量檢測靈芝多糖含量的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術方案為：

使用酶標儀，利用苯酚-硫酸法或者蒽酮-硫酸法對靈芝多糖含量進行檢測，包括以下步驟：

(1)分別將葡萄糖標準溶液和靈芝多糖樣品溶液與顯色試劑混合，置于96孔板中；

(2)在一定溫度放置一定時間，在固定波長檢測；

(3)繪制葡萄糖溶液標準曲線，計算靈芝多糖樣品溶液中總糖含量。

上述步驟中，配制5個以上濃度在10-100μg/mL范圍的葡萄糖標準溶液；通常葡萄糖標準溶液的濃度可以采用20、40、60、80、和100μg/mL的五個濃度點來進行檢測。

上述方法中，顯色試劑可以用苯酚-硫酸溶液或者蒽酮-硫酸溶液。

當顯色試劑用苯酚-硫酸溶液時，采用糖溶液與5％苯酚溶液混合比例為1/1-1/2，優(yōu)選為2/3。采用糖溶液與濃硫酸的體積比為1/4-1/5，優(yōu)選為2/9。反應溫度為25℃，顯色時間為10-30分鐘，優(yōu)選為20分鐘，檢測波長為490nm。

當顯色試劑用蒽酮-硫酸溶液時，糖溶液和蒽酮溶液的體積比為為1/2-1/4，優(yōu)選為1/3。反應溫度為100℃，顯色時間為5-20分鐘，優(yōu)選為10分鐘，檢測波長為620nm。

在檢測過程中，可以利用酶標儀的動力學檢測功能，獲得在不同時間點的吸光值來確認每個樣品的最高吸光值。通過對兩種顯色試劑反應的動力學調查，優(yōu)化試劑混合比例和溫度等參數(shù)，獲得了該檢測方法的穩(wěn)定使用條件。