[發明專利]一種腺嘌呤含量及RIP活性測定方法

在審

• 申請號: 202011532874.3
• 申請日: 2020-12-22
• 公開（公告）號: CN112730284A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 孟堯;孟延發
• 申請（專利權）人: 成都醫學院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/38
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 張娟;鄭勇力

1.一種用于腺嘌呤測試的顯色液，其特征在于：它是由酶和BCIP溶解于pH 6.5-7.5緩沖液制成，所述酶為黃嘌呤氧化酶。

2.按照權利要求1所述的顯色液，其特征在于：所述顯色液中，含酶量和BCIP的用量比例為3.0-4.5U:70-76μmol，優選為，4U：72μmol。

3.一種腺嘌呤含量的間接測定方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)取含有腺嘌呤的待測樣品，加入權利要求1或2所述的顯色液，反應；

(2)測定600-612nm處的光吸收值，優選為606nm處的光吸收值。

4.按照權利要求3所述的測定方法，其特征在于：步驟(1)中：

在每毫升反應體系中，所述酶的加入量為1-1.5U，所述BCIP加入量為23.33-24.13μmol；優選的，所述酶的加入量為1.33U，所述BCIP加入量為24μmol；

和/或，所述反應溫度為35-39℃，優選為37℃，反應時間為20-40min，優選為30min，反應pH條件為6.5-7.5；優選的，所述pH7.0。

5.按照權利要求3所述的測定方法，其特征在于：所述待測樣品中含有腺嘌呤的濃度≤220μM；

和/或，所述待測樣品中腺嘌呤濃度的計算公式為：ΔA＝k×(A-A₀)，其中，ΔA為腺嘌呤濃度，k為吸光度隨腺嘌呤濃度的變化率，A為檢測得到的吸光度，A₀為溶液中腺嘌呤濃度為0時檢測得到的吸光度。

6.一種RIP活性的測定方法，其特征在于，包括如下步驟：

(a)將RIP溶液與反應底物混合，反應，得到含有腺嘌呤的反應液；

(b)將步驟(a)的反應液作為待測樣品，按照權利要求3～5任一項所述的測定方法進行測試，得到光吸收值。

7.按照權利要求6所述的測定方法，其特征在于：步驟(a)中：

所述的反應底物選自ATP或NAD⁺；

和/或，所述反應體系中，反應底物的濃度為8-15mM，優選為10mM；

和/或，所述反應溫度為50-55℃，優選為53℃，反應時間為30-50min，優選為30min，反應pH條件為2.0-3.5；優選的，所述pH由磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液控制。

8.按照權利要求6所述的測定方法，其特征在于：所述RIP活性通過如下公式計算：

U＝(ΔA/t)×(V_t/Ve)或U/mg＝(ΔA/t)×(V_t/Ve)/C，

其中，U為活性單位；U/mg為比活性單位，ΔA為腺嘌呤濃度(μM)，V_t為總反應體積(mL)，V_e為RIP體積(mL)；t為反應時間(min)，C為RIP含量(mg)。

9.一種測定植物樣品中的RIP活性的方法，其特征在于：它是按照權利要求6～8任一項所述的方法測定待測植物樣品的RIP活性。

10.按照權利要求9所述的測定方法，其特征在于，包括如下步驟：

(Ⅰ)向植物樣品加入液氮并研磨，加入pH 6.5-7.0緩沖溶液后，于4-6℃抽提過夜，分離上清液，既得提取液；

(Ⅱ)將步驟(Ⅰ)得到的提取液作為RIP溶液按照權利要求6～8任一項所述的測定方法測定；

優選的，所述植物樣品與緩沖液的比例為1g﹕2ml；

優選的，所述緩沖溶液為含0.9％NaCI的0.05-0.1M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液；

優選的，所述分離上清液的過程為10000-15000g離心15-20min；

優選的，所述植物樣品選自種子、種子胚、發芽種子、莖、根或葉子中的至少一種；和/或，所述植物的種類選自玉米或苦瓜。