[發明專利]靶向氧化石墨烯復合物用于治療耐藥骨肉瘤的實驗方法

在審

• 申請號: 202011531746.7
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN112516311A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 余秋萍;周宗科;曾偉南;王端;于浩達
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: A61K41/00
• 分類號: A61K41/00;A61P35/00;A61K49/00;A61K47/10;A61K47/34;A61K47/04
• 代理公司: 安徽濰達知識產權代理事務所(普通合伙) 34166
• 代理人: 張蘭

1.靶向氧化石墨烯復合物用于治療耐藥骨肉瘤的實驗方法，線粒體靶向氧化石墨烯納米復合物用于熒光成像引導下的協同光療治療耐藥骨肉瘤，其特征在于，包括如下步驟：(1)、實驗細胞、動物及腫瘤異種移植，將MG63/Dox細胞植于小鼠背部皮下，然后用荷瘤小鼠進行活體成像和光療，(2)、PPG、TPP-PPG和TPP-PPG@ICG制備，(3)、表征，對TPP-PPG、ICG和TPP-PPG@ICG的光學特性采用紫外可見近紅外分光光度計進行表征，(4)、單線態氧檢測，用單線態氧綠色熒光探針檢測單線態氧的生成，(5)、光熱轉換實驗，用近紅外光進行照射，使用紅外線溫度計記錄溫度變化，(6)、細胞攝取和細胞內定位，將MG63/Dox細胞培養孵育后，用PBS洗滌后在培養基中重懸，流式細胞儀檢測樣品的平均熒光強度，將MG63/Dox細胞與TPP-PPG@ICG共同培養，PBS洗滌細胞后加入線粒體熒光探針孵育,對線粒體進行標記，PBS再次洗滌細胞后用激光掃描共聚焦顯微鏡掃描獲取圖像，(7)、體外實驗，將MG63/Dox細胞懸液培養加入不同濃度的ICG、TPP-PPG和PPG@ICG溶液，對非照射組PBS洗滌后再次培養，照射組使用808nm NIR照射后再次培養，檢測細胞活力同時進行活細胞/死細胞雙染，將MG63/Dox細胞加入PBS、TPP-PPG@ICG、ICG、TPP-PPG、PPG@ICG及TPP-PPG@ICG培養，加入雙染試劑盒孵育，使用近紅外熒光光譜進行觀察，(8)、細胞凋亡和胞內ROS檢測，MG63/Dox細胞培養NIR照射后低速離心收集細胞，在緩沖液中重新懸浮避光染色后，低速離心收集細胞，PBS洗滌并用結合緩沖液稀釋后進行流式細胞分析，用DCFH-DA試劑盒檢測細胞內ROS的產生，(9)、線粒體膜電位檢測，用JC-1記錄線粒體膜電位的變化，用激光共聚焦顯微鏡采集圖像，(10)線粒體超氧化物檢測，使用線粒體超氧化物熒光探針檢測線粒體超氧化物的產生，(11)、ATP檢測，使用ATP檢測試劑盒繪制ATP濃度標準曲線，(12)、近紅外熒光及熱學成像，對MG63/Dox荷瘤裸鼠尾靜脈注射TPP-PPG@ICG，采用近紅外成像系統進行體外近紅外成像，使用NRI進行照射時使用紅外熱成像相機對小鼠腫瘤組織溫度變化進行實時成像，(13)、體內PDT/PTT聯合治療，將荷瘤小鼠隨機分為6組，PBS非照射組(對照組)、TPP-PPG@ICG非照射組、ICG照射組、TPP-PPG照射組、PPG@ICG照射組和TPP-PPG@ICG照射組，靜脈注射ICG，照射組在腫瘤部位使用808nmNIR進行照射，持續15天，收集腫瘤和主要器官，獲取的內臟進行蘇木精-伊紅染色，并進行顯微鏡觀察。

2.根據權利要求1所述的靶向氧化石墨烯復合物用于治療耐藥骨肉瘤的實驗方法，其特征在于，所述步驟(1)中MG63/Dox細胞混于100μL基質凝膠中進行移植，腫瘤體積達到60mm³時，進行活體成像和光療。

3.根據權利要求1所述的靶向氧化石墨烯復合物用于治療耐藥骨肉瘤的實驗方法，其特征在于，所述步驟(5)中近紅外光采用808nm近紅外光。

4.根據權利要求3所述的靶向氧化石墨烯復合物用于治療耐藥骨肉瘤的實驗方法，其特征在于，所述步驟(8)中MG63/Dox細胞接種在6孔板中過夜，然后加入等效劑量的PBS(-)、TPP-PPG@ICG(-)、ICG(+)、TPP-PPG(+)、PPG@ICG(+)及TPP-PPG@ICG(+)共培養24h。

5.根據權利要求3所述的靶向氧化石墨烯復合物用于治療耐藥骨肉瘤的實驗方法，其特征在于，所述步驟(8)中DCFH-DA試劑盒檢測細胞內ROS的產生，要先將MG63/Dox細胞接種在24孔板中過夜，加入等效劑量的PBS(-)、TPP-PPG@ICG(-)、ICG(+)、TPP-PPG(+)、PPG@ICG(+)及TPP-PPG@ICG(+)共培養24h。