[發明專利]編輯小麥感病基因植株獲得及在抗病品種培育中的應用

有效

• 申請號: 202011531114.0
• 申請日: 2020-12-22
• 公開（公告）號: CN112575012B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 王曉杰;王寧;湯春蕾;樊昕;何夢穎;胡澤宇;王建鋒;康振生
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 西安長和專利代理有限公司 61227
• 代理人: 黃偉洪

本發明屬于抗病品種培育技術領域，公開了一種編輯小麥感病基因植株獲得及在抗病品種培育中的應用，在小麥中有B，D和A三個拷貝。獲得了兩個遺傳背景的TaRIPK1的RNAi突變體。本發明采用農桿菌介導的遺傳轉化方法，利用CRISPR?Cas9基因編輯技術，獲得了TaRIPK1的基因編輯植株。接種小麥條銹菌發現兩個遺傳背景的TaRIPK1 RNAi植株菌對條銹菌毒性小種CYR32有顯著抗性，對TaRIPK1基因編輯技術進行抗病性鑒定，結果發現TaRIPK1基因編輯植株抗病性顯著提升。對小麥條銹菌和葉銹菌主要的流行小種抗性顯著，可用于小麥抗銹病遺傳改良的種質新材料。

技術領域

本發明屬于抗病品種培育技術領域，尤其涉及一種編輯小麥感病基因植株獲得及在抗病品種培育中的應用。

背景技術

目前，小麥作為種植最廣泛的禾谷類作物之一，為全球超過25億人口提供主食(http://www.fao.org/faostat/)。小麥條銹菌、稈銹菌和葉銹菌三種銹菌引起的小麥銹病，是小麥生產上最為臭名昭著的病害(McIntosh et al.，1995；Ellis et al.，2014)。在世界范圍內普遍發生和流行，造成嚴重的產量損失，嚴重威脅著小麥生產和安全(Chen etal.，2014；Park et al.，2015；Han and Kang.，2018)。種植抗病品種是預防小麥銹病最經濟、有效、環保的策略。盡管育種家已經開發了大量的抗病基因，但多數是小種特異性抗性基因，抗病持久性是有限的。并且小麥銹病小種防控中最大的障礙是新的毒性變異小種的不斷出現(Fu et al.， 2009；Zhao et al.，2013；Wang et al.，2016)。因此，培育廣譜抗銹的小麥品種仍然面臨著一定的挑戰。嚴重時在小麥生產上甚至造成90％以上的產量損失(Ellis et al.，2014)。另外，要生產足夠的小麥以滿足不斷增長的人口的需求，氣候變化及其相關的干旱和高溫壓力，以及新出現的降低產量的病害，都對小麥生產和全球糧食安全構成了巨大的挑戰。因此，如何是小麥能夠兼顧生產的需求又能抵抗銹菌的侵害，是抗病育種的關鍵。

植物感病基因對病原菌的成功入侵必不可少，并且在植物與病原菌之間建立的親和互作所必須的。已經報道的感病基因主要有這三個感病機制，(1)能夠幫助病原菌識別和侵入寄主，比如，mlo(感白粉基因)；(2)對于病菌的生長和增殖是有幫助的，比如SWEET家族基因。(3)免疫信號的負調控因子。破壞這些感病基因可以干擾寄主和病原菌的親和互作，從而賦予植物廣譜和持久抗病的能力。近些年來，通過基因操作編輯一些重要作物上的感病基因，已經實現了抗病性的提升。最近的一些研究利用CRISPR基因編輯技術實現了無轉基因的感病基因編輯。目前，通過破壞S基因在多種重要的經濟作物上實現了廣譜抗病性。

綜上所述，現有技術存在的問題是：

(1)小麥感基因的發掘及利用是能夠給與小麥作物改良的最為經濟有效的措施，利用傳統的遺傳改良方法篩選耗時較長，如何快速挖掘抗病及其調控基因面臨著重大的挑戰。

(2)破壞感病基因可以成功干擾病原菌與寄主的親和互作，利用基因編輯手段實現了破壞S基因在水稻等重要經濟作物上的成功編輯，并成功實現了作物的廣譜抗性，那么是否能夠利用已經鑒定的感病基因在小麥上實現成功編輯？

(3)編輯S基因突變體盡管可以實現作物對病害的廣譜抗性，然而多數這種突變體在抗病的潛力下會過度消耗植物生長發育過程中所有的營養，那么如何獲得能夠兼顧抗病和維持生長的小麥材料呢？

解決上述技術問題的難度：利用RNAi技術創制了初步鑒定到的感病基因 TaRIPK1的基因沉默植株，并對不同遺傳背景的TaRIPK1-RNAi植株進行表型鑒定，證實了TaRIPK1的RNAi植株表現出對條銹菌的抗性從野生型的感病轉變為高抗或者近免疫的改變。接著通過構建串聯3個gRNAs的 CRISPR-Cas9-gRNAs載體，然后創制基因編輯的小麥材料，從而實現對感病基因所介導的創制小麥抗銹的新型材料的獲得。