[發(fā)明專利]高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定抑郁癥患者血清中左旋肉堿和乙酰左旋肉堿含量的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011525015.1
• 申請(qǐng)日: 2020-12-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112362793A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏清榮;梁俊;聶麗娟;單鋒;徐亞運(yùn);閆春宇;周旋;程琢玉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 合肥市第四人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N30/06
• 分類號(hào): G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 天津市尚儀知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 12217
• 代理人: 王山

本發(fā)明公開(kāi)了一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定抑郁癥患者血清中左旋肉堿和乙酰左旋肉堿含量的方法，步驟如下：S1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：制備人血清中8個(gè)濃度的ALC，8個(gè)濃度的LC；在一定液相色譜和質(zhì)譜條件下，采用基線減法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，在每批測(cè)定中，通過(guò)運(yùn)行僅添加內(nèi)標(biāo)（IS）的空白血漿樣品進(jìn)行基線減法，根據(jù)分析物濃度繪制一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品的分析物與IS峰面積比值減去空白樣品中分析物與IS峰面積比值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，分別在一定的濃度范圍內(nèi)線性擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線；S2.樣本處理與上機(jī)測(cè)試。本申請(qǐng)能夠同時(shí)測(cè)定抑郁癥患者血清中ALC和LC的含量，步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定抑郁癥患者血清中左旋肉堿和乙酰左旋肉堿含量的方法。

背景技術(shù)

左旋肉堿（LC）是脂肪代謝過(guò)程中的關(guān)鍵物質(zhì)，可促進(jìn)脂肪酸在線粒體氧化分解，乙酰左旋肉堿（ALC）是左旋肉堿的天然形式。在線粒體內(nèi)膜上，ALC 由肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶催化乙酰輔酶A(CoA) 與左旋肉堿合成，并通過(guò)肉堿/乙酰肉堿酰基轉(zhuǎn)位酶進(jìn)入線粒體基質(zhì)，同時(shí)一分子肉堿穿出線粒體基質(zhì)。然后線粒體基質(zhì)中的肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶將酰基肉堿轉(zhuǎn)化為肉堿和乙酰CoA。乙酰CoA 和膽堿在膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶催化下生成乙酰膽堿。 ALC廣泛存在于組織細(xì)胞中，尤其在肌肉，大腦和精子中含量豐富，并且很容易通過(guò)血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)。

ALC具有多種生理活性，包括營(yíng)養(yǎng)作用，神經(jīng)保護(hù)作用，周圍神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛作用，抗氧化作用以及在男性生殖系統(tǒng)中的作用。臨床主要用于改善男性的生育能力，治療阿爾茨海默氏病，肝性腦病，抑郁癥和糖尿病周圍神經(jīng)病變。

抑郁癥是一種常見(jiàn)的精神障礙，研究表明神經(jīng)可塑性受損可能是抑郁癥的核心病理生理機(jī)制。ALC具有許多與神經(jīng)可塑性有關(guān)的多種功能，是一種潛在的抗抑郁藥。ALC通過(guò)乙酰化組蛋白調(diào)節(jié)突觸可塑性，以產(chǎn)生快速的抗抑郁作用。值得注意的是 Carla Nasca等人發(fā)現(xiàn)對(duì)補(bǔ)充ALC迅速產(chǎn)生抗抑郁反應(yīng)的動(dòng)物的血漿和大腦中均表現(xiàn)出內(nèi)源性ALC水平降低。另外，LC和ALC在體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)化。因此，為了研究抑郁癥患者體內(nèi)的LC和ALC水平與抑郁癥發(fā)病的相關(guān)性，需要開(kāi)發(fā)一種靈敏可靠的方法來(lái)定量LC和ALC。

已驗(yàn)證了許多高效液相色譜方法可用于LC和ALC的含量測(cè)定。然而，這些方法需要添加離子對(duì)試劑或固相萃取，這對(duì)于樣品制備而言既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。所以，有必要建立一種同時(shí)測(cè)定抑郁癥患者血清中LC和ALC含量的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，而提供一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定抑郁癥患者血清中左旋肉堿和乙酰左旋肉堿含量的方法。

本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定抑郁癥患者血清中左旋肉堿和乙酰左旋肉堿含量的方法，包括以下步驟：

S1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

制備人血清中濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0和16.0 μg/mL的ALC，濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和16.0 μg/mL的LC；在一定液相色譜和質(zhì)譜條件下，采用基線減法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，在每批測(cè)定中，通過(guò)運(yùn)行僅添加IS的空白血漿樣品進(jìn)行基線減法，根據(jù)分析物濃度繪制一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品的分析物與IS峰面積比值減去空白樣品中分析物與IS峰面積比值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，分別在0.1-16.0 μg/mL和0.5-16.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

S2.樣本處理與上機(jī)測(cè)試：

100 μL血清中加入10 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋振蕩30 s后，加入1mL ACN /水到每個(gè)樣品中以沉淀蛋白質(zhì)，渦旋振蕩1分鐘后在4°C下16000 rpm/min 離心10分鐘除去沉淀物；取上清液注入U(xiǎn)PLC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。