[發(fā)明專(zhuān)利]一種CTSDR與CRISPR/Cas聯(lián)用檢測(cè)miRNA的熒光傳感器及其制備與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011522011.8
• 申請(qǐng)日: 2020-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112626179B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顏玉蓉;丁世家;張德才;李星蓉;鄭清源;甘秀峰;劉萍;舒曉佳;蔡曉穎;白惠潔;凡寧可;程文倩
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6825
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6825;C12Q1/682;C12Q1/6806;G01N21/64
• 代理公司: 上海光華專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 殷興旺

1.一種CTSDR與CRISPR/Cas聯(lián)用檢測(cè)miRNA的熒光傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（a）制備C-B復(fù)合物：采用與crRNA互補(bǔ)的DNA單鏈探針C、封閉探針B制備雙鏈產(chǎn)物C-B復(fù)合物；

所述探針C的核苷酸序列為：

5'-?TCAACATCAGTCTGATAAGCTACATCGCAAAGGCGA-3'；

所述探針B的核苷酸序列為：5'-?GCGATGTAGCTTATCAGAC-3'；

（b）構(gòu)建CTSDR：取步驟（a）所得的C-B復(fù)合物，與單鏈F、靶序列T混合，孵育，獲得含PAM的雙鏈DNA，即Cas12a激活劑；

所述單鏈F的核苷酸序列選自5'-?TGCGATGTAGCTTATCAGACTGA?-3'、?5'-TTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA?-3'、5'-?TTTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA?-3'中的至少一種；所述靶序列T即為miRNA，所述靶序列T的核苷酸序列為：

5'-?UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'；

（c）將預(yù)組裝的Cas12a-crRNA復(fù)合物與標(biāo)記有熒光基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)的單鏈報(bào)告探針加入步驟（b）所得的反應(yīng)液中，混合，孵育；

（d）反應(yīng)完成后，對(duì)蛋白進(jìn)行滅活，得到熒光傳感器。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（a）中，探針C和探針B的摩爾比為1:1；

和/或，所述步驟（a）中，探針C和B通過(guò)變性退火組裝制得所述C-B復(fù)合物；

和/或，所述步驟（b）中，所述單鏈F的核苷酸序列為：

5'-?TTGCGATGTAGCTTATCAGACTGA?-3'；

和/或，所述步驟（b）中，C-B復(fù)合物和單鏈F的摩爾比為1:1；

和/或，所述步驟（b）中，C-B復(fù)合物與單鏈F、靶序列T混合形成的混合液中，C-B復(fù)合物的濃度為1-15?nM，靶序列T的終濃度≥66.4fM；

和/或，所述步驟（b）中，孵育溫度為35-40℃；

和/或，所述步驟（b）中，孵育時(shí)間為20-80min；

和/或，所述步驟（c）中，Cas12a-crRNA復(fù)合物的預(yù)組裝方法為：將?Cas12a與crRNA等比例混合，在室溫下放置10-20min；

和/或，所述步驟（c）中，所述單鏈crRNA的核苷酸序列為：

5'-?UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGAUGUAGCUUAUCAGACUG-3'；

和/或，所述步驟（c）中，所述單鏈報(bào)告探針的核苷酸序列為：5'-?FAM-TTATT-BHQ1-3'；和/或，所述步驟（c）中，孵育在避光條件下進(jìn)行；

和/或，所述步驟（c）中，孵育溫度為35-40℃；

和/或，所述步驟（c）中，孵育時(shí)間為40-80min；

和/或，所述步驟（d）中，蛋白滅活溫度為60-80℃；

和/或，所述步驟（d）中，蛋白滅活時(shí)間為5-15min。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（a）中，變性溫度為90-100℃；

和/或，所述步驟（a）中，變性時(shí)間為5-10min；

和/或，所述步驟（a）中，先將探針C和B溶解于緩沖液中，進(jìn)行變性反應(yīng)，變性反應(yīng)結(jié)束后立即復(fù)性，制得所述C-B復(fù)合物。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（a）中，復(fù)性溫度為35-40℃；

和/或，所述步驟（a）中，復(fù)性時(shí)間為0.5-2h；

和/或，所述步驟（a）中，所述緩沖液選自NEBuffer?3.0NEBuffer?2.1、NEBuffer?3.1。