[發(fā)明專利]TNFRSF1B基因人源化動物模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011519216.0
• 申請日: 2020-12-21
• 公開（公告）號: CN112608942A
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 費(fèi)儉;孫瑞林;王津津;周宇;池駿
• 申請（專利權(quán)）人: 上海南方模式生物科技股份有限公司;上海砥石生物科技有限公司;廣東南模生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10;A01K67/027;A61K49/00;C12Q1/02
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 張麗

1.一種TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

在非人動物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入人TNFRSF1B基因，使所述人TNFRSF1B基因在非人動物細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生人源化的TNFRSF1B蛋白，同時降低或消除所述非人動物細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源TNFRSF1B基因的表達(dá)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，利用基因編輯技術(shù)對非人動物細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源TNFRSF1B基因進(jìn)行改造，得到人源化TNFRSF1B基因；

優(yōu)選地，所述非人動物為嚙齒類動物；更優(yōu)選地，所述嚙齒類動物為小鼠；

優(yōu)選地，所述細(xì)胞為受精卵細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述人源化TNFRSF1B基因選自下列組中的至少一種：

(a)所述人源化TNFRSF1B基因的CDS編碼序列如SEQ ID NO：8所示；

(b)所述人源化TNFRSF1B基因轉(zhuǎn)錄的mRNA序列如SEQ ID NO：9所示；

(c)所述人源化TNFRSF1B基因編碼的蛋白序列如SEQ ID NO：10所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)；所述構(gòu)建方法具體包括：提供包括人TNFRSF1B基因同源重組載體、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9mRNA和/或Cas9蛋白，將所述混合物注射到所述非人動物細(xì)胞中，將所述非人動物細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述非人動物為小鼠，所述人TNFRSF1B基因同源重組載體包括從5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人TNFRSF1B基因、小鼠Tnfrsf1b基因、polyA以及3’同源臂。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述人TNFRSF1B基因的序列包括人TNFRSF1B基因內(nèi)含子1的部分序列與人TNFRSF1B基因的部分編碼區(qū)序列，所述人TNFRSF1B基因內(nèi)含子1的部分序列如SEQ ID NO：1所示，所述人TNFRSF1B基因的部分編碼區(qū)序列如SEQ ID NO：2所示；

優(yōu)選地，所述小鼠Tnfrsf1b基因的序列如SEQ ID NO：3所示；

優(yōu)選地，所述小鼠Tnfrsf1b基因與所述polyA之間還設(shè)置有WPRE調(diào)控元件，所述WPRE調(diào)控元件的序列如SEQ ID NO：4所示；

優(yōu)選地，所述polyA的序列如SEQ ID NO：5所示；

優(yōu)選地，所述5’同源臂的DNA序列如SEQ ID NO：10所示；

優(yōu)選地，所述3’同源臂的DNA序列如SEQ ID NO：11所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，所述sgRNA的靶位點(diǎn)序列如SEQ ID NO：20-29任一項所示；

優(yōu)選地，所述sgRNA的靶位點(diǎn)序列如SEQ ID NO：29所示。

8.一種TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞，其特征在于，所述TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞由權(quán)利要求1-7中任一項所述的TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞的構(gòu)建方法獲得。

9.一種TNFRSF1B基因人源化動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，將如權(quán)利要求8所述的TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞或者由所述TNFRSF1B基因人源化動物細(xì)胞發(fā)育得到的胚胎移植至代孕母體內(nèi)進(jìn)行發(fā)育，得到F0代動物；

對F0代動物進(jìn)行檢驗，獲得基因型鑒定正確的F0代陽性動物。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的TNFRSF1B基因人源化動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，還包括：將所述F0代陽性動物與野生型動物交配，擴(kuò)大種群數(shù)量，同時雜合子動物與雜合子動物交配獲得純合子動物，建立穩(wěn)定的TNFRSF1B基因人源化動物品系。