[發明專利]一種耐熱植酸酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202011519196.7
• 申請日: 2020-12-21
• 公開（公告）號: CN112626048B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 吳丹;鄭璞;陳鵬程;陳中偉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;A23K20/189;A23K50/30;A23K50/75;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種耐熱植酸酶突變體及其應用，屬于酶工程領域。通過隨機突變的方法對來源于大腸桿菌Escherichia coli植酸酶基因appA進行改造，多輪篩選得到一種突變體蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3。本發明篩選得到的植酸酶突變體appA?M最適pH為4.5，最適溫度為65℃，在90℃處理10min后保留30％的酶活。與野生酶相比，植酸酶突變體appA?M的熱穩定性得到顯著提高。所述植酸酶突變體可以廣泛應用于豬禽飼料中，從而有利于減少飼料制粒過程中酶活力的損失，降低飼料成本，同時還能降低磷排放對環境的污染。

技術領域

本發明涉及一種耐熱植酸酶突變體及其應用，屬于酶工程領域。

背景技術

植酸又稱肌醇六磷酸，廣泛存在于農作物的種子中，是谷物中磷的主要儲存形式，約占60％-80％。在單胃動物中，植酸和植酸鹽不能被直接吸收利用，只能隨著動物的糞便排出，然而過量磷排放則會導致水體富營養化，對環境影響十分嚴重。并且由于動物對磷的需求無法得到滿足，必須額外添加無機磷，這樣無形之中造成磷資源的極度浪費。另外植酸具有強鰲合能力，可以與鐵、鎂、鋅、鈣等金屬離子以及胰蛋白酶、淀粉酶等消化酶結合，在植物性飼料中成為一種抗營養因子，影響單胃動物對礦物質的利用。

植酸酶又稱肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸或植酸鹽水解成肌醇和磷酸或磷酸鹽的一類酶的總稱，屬于正磷酸單酯水解酶家族，廣泛存在于植物、動物和微生物中。大量研究表明，在豬、禽類飼料中添加適量的植酸酶可使磷利用率提高60％左右，動物糞便的磷排放減少30—50％。這不僅降低了飼料的生產成本，而且還減少了環境污染。

然而，植酸酶在飼料生產過程的短暫高溫處理中需要足夠的耐熱性。大腸桿菌來源的植酸酶活性良好，發酵活力較高，適用于高水平表達系統。但其耐熱性較低，相比黑曲霉來源的植酸酶相差較大。因此，進一步提高大腸桿菌來源的植酸酶的耐熱性，成為飼用植酸酶的研究熱點之一。

發明內容

本發明所要解決的問題是提供一種耐熱植酸酶突變體及其應用。

本發明的第一個目的是提供一種植酸酶突變體，所述突變體含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在本發明的一種實施方式中，所述植酸酶突變體是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的植酸酶的第120位氨基酸由絲氨酸(Ser)變為天冬酰胺(Asn)，第137位氨基酸由天冬酰胺(Asn)變為天冬氨酸(Asp)，第219位氨基酸由谷氨酸(Glu)變為蘇氨酸(Thr)。

本發明的第二個目的是提供編碼上述植酸酶突變體的基因，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:4。

本發明的第三個目的是提供含有核苷酸序列為SEQ ID NO:4的重組載體。

本發明的第四個目的是提供表達上述植酸酶突變體的基因工程菌，以pET系列質粒為載體，以大腸桿菌為宿主。

在本發明的一個實施方式中，所述質粒是pET22b(+)。

在本發明的一個實施方式中，所述宿主大腸桿菌是E.coli BL21(DE3)。

本發明的第五個目的是提供含有上述植酸酶突變體或表達植酸酶突變體的基因工程菌在豬禽飼料中的應用。

有益效果：

本發明獲得的植酸酶突變體appA-M最適pH為4.5，在pH3.0-6.0有50％以上活性，最適溫度為65℃，比野生酶提高5℃，在90℃處理10min后保留30.3％的酶活，熱穩定性較野生酶提高27.7％。所述耐熱植酸酶突變體可廣泛應用于豬禽飼料中，從而有利于減少飼料制粒過程中酶活力的損失，降低飼料成本，同時還能降低磷排放對環境的污染。

附圖說明

圖1為易錯PCR隨機突變PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。