[發明專利]一種谷氨酸脫羧酶突變體及其在生產γ-氨基丁酸中的應用

有效

• 申請號: 202011514707.6
• 申請日: 2020-12-21
• 公開（公告）號: CN112251428B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 劉君;徐寧
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N15/77;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19;C12R1/15
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 歐陽石文

本發明提供一種催化性能提升的谷氨酸脫羧酶突變體及其應用，所述突變體是來源自巨大芽孢桿菌CICC 10055的野生型谷氨酸脫羧酶SEQ ID NO:1第280位氨基酸由酪氨酸Y突變為甲硫氨酸M得到。通過谷氨酸脫羧酶的活性測定分析，發現相較于野生型谷氨酸脫羧酶，本發明的谷氨酸脫羧酶突變體Y280M在不同pH或溫度條件下都表現出明顯提高的酶活性，提示其更適合工業化生產γ?氨基丁酸。

技術領域

本發明公開了一種活性增強的谷氨酸脫羧酶突變體及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyricacid, GABA)是一種重要的抑制性神經遞質，具有降低血壓、抗焦慮和抑郁、改善睡眠、提高記憶力、治療癲癇等生理功能，在食品、醫藥和飼料等領域具有廣泛的市場前景。γ-氨基丁酸因較好的生理功能和應用前景受到廣泛關注，并被應用于食品、醫藥和化妝品中。日本厚生省、歐洲食品安全局和美國食品藥品管理局承認乳酸菌發酵生產的GABA為天然食品添加劑。我國衛生部也批準此類產品為新資源食品。此外，γ-氨基丁酸還可用于合成2-吡咯烷酮，2-吡咯烷酮可用于合成尼龍-4，具有重要的工業應用價值。據粗略統計，目前全球各類 GABA 總產能約6萬噸/年，約10 %屬于微生物法或植物富集法生產的可以應用于食品或醫藥等領域。

目前，γ-氨基丁酸生產包括化學合成法、植物富集法和微生物合成法等。化學合成的GABA有原料殘留，因此安全性差，不能添加到食品中；植物中GABA含量低，富集提取成本較高；而微生物合成GABA因安全性高、生產成本低和對環境友好更具開發價值。谷氨酸脫羧酶（EC 4.1.1.15）能不可逆地催化L-谷氨酸（鹽）轉化生成γ-氨基丁酸，是生物轉化法合成γ-氨基丁酸的關鍵酶制劑，具有巨大的市場應用價值。但是，目前國內外已報道的谷氨酸脫羧酶一般催化效率較低且酶活性范圍偏酸性，這一特性已經嚴重影響了其在工業上的應用前景。

因此，通過篩選或分子改造谷氨酸脫羧酶，獲得具有優良的催化性能的關鍵酶制劑，并基于此構建高效生物催化系統，是實現γ-氨基丁酸高產需要解決的主要技術問題之一。

發明內容

本發明的目的在于提供一種催化性能提升的谷氨酸脫羧酶突變體及其重組菌株，并使用該菌株建立了高效生產γ-氨基丁酸的全細胞轉化方法。

本發明首先提供了一種酶活提高的谷氨酸脫羧酶突變體，是將對應于來源自巨大芽孢桿菌CICC 10055的野生型谷氨酸脫羧酶SEQ ID NO:1第280位氨基酸由酪氨酸Y突變為甲硫氨酸M的氨基酸序列。所述谷氨酸脫羧酶突變體包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述谷氨酸脫羧酶突變體的編碼核苷酸序列可以是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

其次，本發明提供表達了一種生產γ-氨基丁酸的雙酶共表達載體，所述共表達載體是在一個質粒中同時導入谷氨酸脫羧酶突變體和γ-氨基丁酸轉運蛋白的編碼基因。進一步地，本發明提供一種重組菌株，其是將所述雙酶共表達載體轉化或導入宿主菌株所得。宿主菌株選自棒桿菌屬、腸桿菌屬或短桿菌屬菌株，優選地是谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌、黃色短桿菌、鈍齒棒桿菌枯草芽孢桿菌等。

在一個實施方案中，所述雙酶共表達載體中γ-氨基丁酸轉運蛋白含有如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列，其編碼核酸序列如SEQ ID NO:6所示。根據本發明，用于所述突變體表達的載體種類沒有特殊限定，可以為能夠在菌株中表達目的基因的本領域常用的各種表達載體，用于所述突變體表達的宿主菌株也沒有特殊限定，可以為本領域技術人員已知的各種模式菌株。

最后，本發明提供了一種高效制備γ-氨基丁酸的方法。采用發酵罐進行重組菌株的高密度發酵和蛋白誘導表達，制備全細胞催化菌泥；在純水相體系中加入L-谷氨酸（鹽）底物和全細胞催化菌泥，常溫常壓下進行γ-氨基丁酸制備。